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膳食植物中含有多种功能成分,如糖类、脂类、多肽、黄酮、皂苷、甾醇、单萜和生物碱等物质,提取这些成分并将其加到食品中不仅可以作为一种天然的抗氧化剂,并且对于维持人体健康、调节生理功能和预防疾病等方面具有重要的作用。其中天然膳食植物中的黄酮类物质由于其含量丰富、生理活性强、稳定性高而备受人们的关注。天然膳食植物中95%以上的黄酮是以糖苷形式存在的,其中以黄酮-C-苷和黄酮-O-苷类物质居多,相比于黄酮-C-苷类物质,黄酮-O-苷类物质具有更强的耐酸性和耐酶解性,而显示了其自身的优越性和良好的生物利用度异槲皮苷(Isoquercitrin,简称ISO),分子式为C21H20O12,是槲皮素的氧苷衍生物,广泛存在于中草药、蔬菜和水果等中。体内和体外实验均表明,异槲皮苷能够显著预防机体氧化损伤、癌症、过敏反应、糖尿病和心脑血管等疾病,并且ISO的生物活性要优于槲皮素。然而,目前绝大部分研究都集中于槲皮素的研究,而对异槲皮苷研究基本停留在生物活性层面,而对其内在机理尤其是抑制肿瘤细胞增殖的机理的报道较少。基于此,本文以ISO为研究对象,以膀胱癌细胞为作用目标,在细胞分子水平上模拟人体环境,全方位评价了ISO抑制膀胱癌细胞增殖的分子机制,从而为ISO化合物在食品中的高效利用提供基础数据,同时为膀胱癌等慢性疾病的预防提供理论指导。1.通过红细胞溶血实验分析得知:ISO能够显著提高细胞体内抗氧化物酶-超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的活性,从而保护细胞免受氧化损伤,保证细胞结构完整,来预防肿瘤的发生。随后,采用MTT法评价了ISO对膀胱癌细胞EJ和T24以及正常膀胱细胞SV-HUC-1的抗增殖活性得到:在pH7.2的条件下,ISO对膀胱癌细胞EJ和T24均有显著的抑制作用,其半数抑制浓度IC50分别为28.8μM和34.4μM,其抑制膀胱癌细胞增殖活性与阳性对照组槲皮素相近;但是在pH6.2的微酸性环境中,相比于槲皮素,ISO能够更稳定的抑制膀胱癌细胞的增殖,其IC50分别是62.32μM和55.7μM;并且相比于阳性对照组紫杉醇,ISO对人体正常膀胱细胞SV-HUC-1的毒性更低;进一步分析ISO对EJ和T24对的迁移效果影响表明:ISO能够抑制膀胱癌细胞EJ和T24的迁移,并且对T24的迁移抑制作用更为显著。以上结果均表明,ISO对膀胱癌细胞EJ和T24具有较强的抑制效果,并且其对正常膀胱细胞SV-HUC-1的毒性要低于紫杉醇。2.运用流式细胞术分析发现,随着ISO药物浓度的增加,EJ和T24细胞的SubG1峰和G2/M期DNA的比例逐渐上升,表明ISO抑制膀胱癌细胞EJ和T24增殖是通过细胞凋亡和G2/M期周期阻滞来实现的;通过DHE法检测细胞中ROS水平,表明ISO抑制膀胱癌细胞T24增殖与其清除胞内ROS的能力有关。进一步运用Western blotting得到了ISO抑制T24细胞增殖的信号通路,对ROS介导的T24细胞凋亡和G2/M细胞周期阻滞中相关蛋白进行分析,结果表明:ISO促进T24细胞产生过量的ROS从而启动p53、AKT和MAPKs信号通路,这些信号通路又进一步激活相应下游信号分子,最终激活外源性死亡受体途径和内源性线粒体途径引起细胞凋亡;ISO还能够下调CyclinB1和CDK4/6的表达,上调相关抑制因子p15、p21和p27的表达,促进JNK的磷酸化诱导T24细胞发生G2/M细胞周期阻滞。3.运用UHOLC-QTOF-MS进行代谢组学检测,进一步探究了ISO抑制T24细胞增殖的机理,结果显示:在正负离子模式下,T24细胞经过80μM的ISO处理后,细胞内共有784种代谢产物存在显著性变化(fold change>2),共涉及7条代谢通路,其中主要对脂质合成和糖酵解途径产生抑制;运用Western blotting实验表明:ISO主要通过AMPK-mTOR通路调节T24细胞的脂质合成和糖酵解,进而启动下游相关信号分子,导致细胞凋亡和G2/M期周期阻滞。