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乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一,转移是乳腺癌患者死亡的主要原因。了解乳腺癌的侵袭、转移机制对于乳腺癌的治疗具有重大社会意义。非肌细胞肌球蛋白Ⅱ(NMⅡ)为细胞骨架的重要组成部分,参与细胞多种生命活动过程。NMⅡ是一个由重链(NMHC)和轻链(NMLC)组成的六聚体结构,轻链对重链起着稳定和调节作用,重链通过磷酸化活化调控细胞的运动。因而,NMHCⅡ对肿瘤细胞运动是否存在调控作用引起我们的关注。我们前期的研究结果显示,NMHCⅡ在乳腺癌细胞的迁移、侵袭等肿瘤的转移的起始阶段起着重要的调控作用。沉默NMHCⅡ各亚型时,乳腺癌细胞的迁移侵袭等过程都受到了很大的限制。但是调控这一现象的机制尚不清楚。整合素是由α亚基和β亚基组成的位于细胞膜上的异二聚体,属于黏附分子超家族的一员。整合素的特殊的跨膜结构可以分为胞外域和胞内域。胞外域可以与不同的细胞外基质分子相结合,从而传递相应的化学信号,胞内域可以与细胞骨架蛋白相连,引发骨架蛋白的重排。已有研究显示,增加整合素的表达可以增加肿瘤的恶性程度和侵袭能力,这些改变与细胞骨架重构和收缩力的产生密切相关,其机制可能与α5β1细胞对于MLC磷酸化活化有关,但是否与NMHC有关尚未可知。综上所述,我们推测,肿瘤转移过程的起始阶段,整合素可能通过NMLC活化调控NMHCⅡ磷酸化活化,导致细胞骨架重构和收缩力的产生,从而引发肿瘤细胞的迁移、侵袭等一系列生物学活动。研究目的:研究乳腺癌转移过程中,整合素α5通路对NMHCⅡA的调控及对乳腺癌细胞的生物学行为的影响。研究方法:1、利用免疫组织化学染色的方法观察整合素α5、NMHCⅡA活化形(p-S1943)2、在乳腺组织中的表达情况。3、在乳腺癌中,整合素α5与NMHCⅡA及其活化形式的关系。(1)通过慢病毒转染沉默MDA-MB-231细胞中整合素α5,通过免疫荧光和流式细胞术检测转染效率,通过western blot、流式细胞术和免疫荧光染色检测其沉默效率。(2)通过Western Blot检测沉默整合素α5后细胞内NMHCⅡA及其活化形式p-S1943的表达水平。(3)沉默整合素α5后对肿瘤细胞生物学行为的影响。(1)应用CCK-8检测沉默整合素α5后对细胞增殖的影响。(2)通过流式细胞术检测沉默整合素α5后细胞周期的改变。(3)通过细胞的划痕实验来分析沉默整合素α5后细胞迁移能力的改变。(4)通过transwell体外侵袭实验来检测沉默整合素α5后,细胞侵袭力的改变。(5)通过黏附实验检测沉默整合素α5后,细胞粘附力的改变。(6)通过免疫细胞爬片测量单个细胞的铺展面积检测细胞铺展能力的改变。研究结果:1、免疫组化染色的结果发现,浸润性导管癌中的整合素α5、P-S1943的表达高于纤维腺瘤及乳腺增生;且浸润性导管癌与乳腺增生的组间差异有统计学意义(P<0.05)。整合素α5与p-S1943的表达具有共定位的现象;且整合素α5与p-S1943存在相关性(R=0.76)。在有淋巴结转移的乳腺癌中p-S1943、整合素α5的表达均高于非淋巴结转移组,组间有统计学意义(P<0.05)。2、整合素α5与NMHCⅡA及其活化形式的关系。(1)获得转染后的MDA-MB-231细胞株,通过荧光和流式细胞术检测转染效率,发现三组细胞都在90%以上,利用Western Blot、流式细胞术和免疫荧光染色检测沉默效率,发现序列号为16381的慢病毒具有最高的沉默效率(P<0.05)。(2)Western Blot的结果显示,沉默整合素α5后,细胞内NMHCⅡA及其活化形式p-S1943表达均降低,与空载组和未转染组相比,组间差异有统计学意义(P<0.05)。(3)沉默整合素α5后对肿瘤细胞生物学行为的影响。(1)细胞生长曲线和流式细胞术检测细胞周期的结果均显示,沉默整合素α5对MDA-MB-231细胞的增殖和周期均没有明显影响,与空载组和未转染组相比,组间差异没有统计学意义(P>0.05)。(2)细胞划痕实验结果说明,沉默整合素α5后,细胞迁移能力减弱,与空载组和未转染组相比,组间差异有统计学意义(P<0.05)。(3)细胞侵袭实验结果表明,沉默整合素α5后,细胞穿过人工基底膜的数目明显降低,与空载组和未转染组相比,组间差异有统计学意义(P<0.05)。(4)细胞黏附实验表明,沉默整合素α5后,细胞黏附能力明显将低,与空载组和未转染组相比,组间差异有统计学意义(P<0.05)。(5)沉默整合素α5后,单个细胞的铺展面积明显低于空载组和未转染组,组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1.乳腺癌中,整合素α5对NMHCⅡA有调控作用。2.乳腺癌中,整合素α5对肿瘤细胞的侵袭、迁移、黏附、铺展等生物学行为有调节作用。3.整合素α5可能通过调控NMHCⅡA来调节乳腺癌细胞的生物学行为。