论文部分内容阅读
背景：随着干细胞在临床上的广泛应用,骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells, BMSCs)已经成为众多种子细胞研究的热点。目前对骨髓间充质干细胞的体外分化机制尚不明确,以往众多研究集中在骨形态发生蛋白上,而对其他基因的研究尚少,而最近在细胞分化领域内研究的热点基因膜联蛋白A1(Annexin A1)在骨髓间充质干细胞分化中的研究甚少,且研究方法过于单一,无法全面的解释该基因的细胞分化功能。我们的研究旨在综合性的探讨骨髓间充质干细胞分化过程中膜联蛋白A1基因表达的变化意义。第一部分兔骨髓间充质干细胞体外培养与鉴定目的：体外分离并培养高纯度和生长状态稳定的骨髓间充质干细胞。方法：应用全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,传代培养纯化,并鉴定其特异性表面标记物；分别用成骨诱导剂和成脂诱导剂诱导分化骨髓间充质干细胞,检测细胞分化活性。结果：骨髓间充质干细胞生长状态及分化活性良好,细胞表面标记物CD44、CD105表达率达95%以上,而CD45阴性表达。结论：全骨髓贴壁法培养的骨髓间充质干细胞生长状态良好,易于诱导。第二部分膜联蛋白A1基因在BMSCs成骨分化和成脂分化早期的表达目的：(1)研究兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)在体外诱导成骨和成脂过程中膜联蛋白A1基因的表达变化。(2)监测骨髓间充质干细胞在诱导分化过程中的细胞生长状态。方法：(1)实验组分别加入含成骨诱导剂和成脂诱导剂的培养基,对照组细胞以不添加任何诱导剂的培养基培养。(2)分别在3、7天提取细胞总mRNA,并应用荧光定量RT-PCR技术检测各组膜联蛋白A1基因表达情况。(3)应用MTT法检测细胞生长、细胞流式学检测细胞增殖情况与凋亡情况。结果：(1)膜联蛋白A1基因在成骨诱导过程中与未诱导组相比有明显下调趋势(3天2-△△CT=0.643±0.076,7天2-△△CT=0.862±0.028,差异有统计学意义(P<0.01),而在成脂诱导组中则为上升(3天2-△△CT=1.264±0.115,7天2-△△CT=1.860±0.045；(2)成骨诱导液对MSCs生长存在抑制作用并增加细胞凋亡(P<0.01),而成脂诱导剂对MSCs的生长与凋亡作用甚小。结论：(1)成骨诱导液对骨髓间充质干细胞的生长起到抑制作用,并可促进细胞凋亡；(2)膜联蛋白A1基因可能与骨髓间充质干细胞的体外成脂分化存在一定关系,但尚不能肯定其在成骨分化中的作用。通过对膜联蛋白A1基因的研究,有可能为骨髓间充质干细胞向成骨细胞或脂肪细胞分化的机制提供线索和新的研究方向。