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硫化氢(H2S)在动物体内经酶系催化合成,能够调节动物的许多生理过程,并且通过许多胞内靶标影响多种细胞活动。但此研究领域仍有许多空白需填补。黑腹果蝇Drosophila melanogaster具有生活史短、繁殖力强、其80％的基因是与人类同源及许多遗传标记因子等优势条件,成为我们研究H2S生理效应的模式生物。
1.果蝇内源性硫化氢产生相关蛋白的系统进化分析
同源搜索得到了23个动物物种中编码甲硫氨酸腺苷转移酶、甘氨酸N-甲基转移酶、胱硫醚β-合成酶和胱硫醚γ-裂解酶的基因,并构建了系统发生树。结果显示,这4种酶具有基本一致的系统进化关系。4类蛋白均大致归为CladeⅠ和CladeⅡ两个大类群,构成CladeⅠ大类群的每一种酶全部来自昆虫,而构成CladeⅡ大类群的每一种酶全部来自哺乳动物。12种果蝇全都聚在一起,亲缘关系由近及远依次是埃及伊蚊、冈比亚按蚊和致倦库蚊,之后是赤拟谷盗、丽蝇蛹集金小蜂和蜜蜂,最后是哺乳动物。黑腹果蝇的这4种酶可能跟哺乳动物的这些酶有类似的功能,从而暗示果蝇体内也自发产生内源性H2S。
2.果蝇内源性硫化氢产生相关基因的转录分析
采用实时荧光定量PCR技术,分析了黑腹果蝇不同发育阶段编码甲硫氨酸腺苷转移酶、甘氨酸N-甲基转移酶、胱硫醚β-合成酶和胱硫醚γ-裂解酶的基因M(2)21AB、CG6188、CG1753和Eip55E的mRNA水平。在卵、1-3龄幼虫、蛹和成虫中,这4个基因均表达。除M(2)21AB外,CG6188、CG1753、Eip55EmRNA水平在各发育阶段变化比较大。CG6188mRNA的表达在卵期较低,到了幼虫期显著升高,尤其在2龄幼虫期达到最高,在蛹期和成虫期明显下降。1龄幼虫期和2龄幼虫期CG6188mRNA显著高于另外4个发育阶段,分别是卵的12倍和15.7倍。CG1753 mRNA的表达在1、2和3龄幼虫期明显上升,分别是卵的3.9倍、5.2倍和2.3倍；至蛹期达到表达的最高水平,上升至卵的7倍；在成虫期又显著降低至卵的3.5倍。Eip55EmRNA水平自幼虫期开始显著上升,在1龄幼虫期为卵的2.4倍；2龄达到最高,是卵的4倍；3龄是卵的3.2倍；蛹期和成虫期分别是卵的1.9倍和2.8倍。3个龄期幼虫、蛹及成虫Eip55E mRNA水平均比卵期显著提高。
3.硫化氢对黑腹果蝇幼虫存活、成虫生殖和寿命的影响
以K2S溶液作为H2S供体,测定了H2S对黑腹果蝇幼虫存活率和成虫产卵和寿命的影响。当食物中K2S终浓度分别为0、0.0005、0.005、0.05、0.5和5μmol/g时,黑腹果蝇存活率(从卵到成虫的羽化比率)分别是0.735、0.933、0.892、0.714、0.609和0.654。在浓度分别为0.0005和0.005μmol/g时,K2S的加入显著提高了黑腹果蝇的存活率。K2S在低浓度(0.0005、0.005、0.05和0.5μmol/g)下迟滞产卵；而在高浓度(5μmol/g)下刺激产卵。食物中K2S明显缩短未交配黑腹果蝇成虫的存活时间。食物中KES含量为0、0.0005、0.005、0.05、0.5和5μmol/g时,未交配雄黑腹果蝇的平均存活时间分别是54.9、47.2、45.4、52.1、47.2和40.7 d；未交配雌黑腹果蝇的存活时间分别是60.7、54.4、59.8、46.3、53.0和50.0 d。但食物中K2S对未交配雄蝇和雌蝇最长寿命的影响较复杂,无明显规律。
4.不同日龄果蝇对硫化氢的趋性
测定了性未成熟和成熟期雌雄黑腹果蝇对H2S的剂量反应。发现无论是性未成熟还是成熟期的雌雄黑腹果蝇成虫,对H2S的剂量反应一致。即在低浓度时具有较弱的正趋性,正趋性随浓度升高而增强,达到顶峰后正趋性逐渐下降,随着浓度的进一步增大而出现负趋性。随着黑腹果蝇性的成熟及生殖的启动,对高浓度H2S气体的负趋性大幅减弱。分析了编码酶甲硫氨酸腺苷转移酶、甘氨酸N-甲基转移酶、胱硫醚β-合成酶和胱硫醚γ-裂解酶的基因M(2)21AB、CG6188、CG1753和Eip55E在未成熟和成熟期雌、雄蝇中mRNA相对表达量,发现随着黑腹果蝇性的成熟及生殖的启动,这些基因表达量均上调,其中CG6188和CG1753上调幅度更大。
5.硫化氢提高果蝇干燥耐受性
建立了一套挥发物生测系统用来评价黑腹果蝇成虫经H2S处理后的存活率。利用这个生测系统,我们发现在干燥且缺乏食物的条件下,H2S处理显著提高黑腹果蝇的存活能力,而在潮湿缺乏食物的条件下却无影响。说明H2S提高黑腹果蝇的干燥耐受性而不是饥饿耐受性中。为了进一步证实这一结果,利用qRT-PCR比较来自H2S处理和对照黑腹果蝇的2种耐干燥相关基因Frost和Desat2,以及1种耐饥饿相关基因Smp-30的mRNA水平。黑腹果蝇在干燥和缺乏食物条件下,这3个基因在2 h内都上调。并且,H2S进一步调高了耐干燥基因Frost和Desat2 mRNA表达水平,而对耐饥饿Smp-30却无影响。我们的分子实验结果与生测结果相互印证。由于分子生物学和遗传学上的易操作特性,果蝇将是研究H2S调节动物生理变化的有效模式生物。
6.硫化氢可能通过p38 MAPK与/或KATP通道调节果蝇的行为与生理
p38 MAPK信号通路和KATP通道信号通路与哺乳动物的生殖系统调节及抗逆反应都相关。结合我们的实验结果,我们推测H2s可能通过p38 MAPK和KATP通道信号通路发挥其生理效应。