论文部分内容阅读
目的：改良传统的DMN肝纤维化造模方法，探讨肝纤维化过程中TGF-β1/Smads通路信号分子的变化特点；观察丹酚酸B对不同病理阶段的肝纤维化的作用，并探讨该药影响肝脏TGF-β1/Smads信号转导而抗肝纤维化部分作用机制。
方法：
1.二甲基亚硝胺(DMN)腹腔注射，Wistar雄性大鼠30只以常规方法(DMN10μg·kg-1，每周连续3d，连续4w，共12次)，Wistar雄性大鼠90只以改良方法(DMN10μg·kg-1，2d一次，连续4w，共14次)诱导大鼠肝纤维化，分为正常组，模型组。常规方法分为4w，8w；改进方法组分为3d，1w，2w，4w，5w，6w，8w动态观察点。Wistar雄性大鼠78只，以改良方法造模，丹酚酸B盐分别在染毒开始(预防组)和染毒2w末(干预组)以10mg/kg灌胃，持续4w，两组均设正常组，模型对照组，培哚普利组。培哚普利组在相应时间灌服培垛普利5mg·kg-1，分别于造模4w末和6w末处死全部大鼠。
2.HE染色和天狼星红染色分别观察大鼠肝脏炎症及胶原沉积的病理改变；免疫组化染色观察Ⅰ型胶原，Smad3蛋白的表达。
3.试剂盒法观察大鼠血清肝功能(ALT、总胆红素等)变化。Jamall氏盐酸水解法检测大鼠肝组织羟脯氨酸(hydroxyprolineHyp)含量变化。
4.Western印记法分析大鼠肝组织α-SMA、Ⅰ型胶原、TGF-β1、TβR-Ⅱ/Ⅰ、Smad2、磷酸化Smad2、Smad3蛋白表达的变化。
5.明胶酶图法分析大鼠肝组织MMP-2、MMP-9的活性变化。
6.RT-PCR观察Ⅰ型胶原mRNA，RealtimePCR观察TGF-β1的mRNA表达的变化。
结果：
1.与常规方法比较，改良造模方法死亡率明显降低，病理染色显示肝纤维化以肝窦毛细血管化更为明显，而常规组以汇管区和中央静脉形成粗大的纤维间隔为主；改良方法随染毒的进行，与正常组比较，模型组肝组织胶原逐渐沉积、肝功能异常、肝组织Hyp含量增多、Ⅰ型胶原和α-SMA蛋白表达增多、MMP-2、MMP-9的活性增强，4w时病变最明显，染毒结束后有所恢复。
2.随着染毒的进行，与正常组比较，模型大鼠肝组织TGF-β1蛋白及mRNA、TβR-Ⅰ蛋白表达明显增加，染毒结束后有所恢复，但仍维持在较高水平，TβR-Ⅱ蛋白表达变化不大；在整个染毒过程中，Smad2、Smad3蛋白表达无明显变化，但Smad2的磷酸化水平明显升高，Smad3在间质细胞的胞核表达增多。
3.与模型组比较，丹酚酸B盐预防用药和干预用药均能改善大鼠肝功能，降低肝组织Hyp含量，减轻肝组织过量沉积的胶原，有抗肝纤维化与抗肝损伤的作用，并且在模型大鼠炎症时期的干预用药疗效明显。
4.与模型组比较，丹酚酸B盐干预用药组显著下调大鼠肝组织TGF-β1蛋白及mRNA、TβR-Ⅰ蛋白表达、抑制Smad2的磷酸化水平及Smad3的活性。
结论：
1.每两天给药的(DMN10μg·kg-1大鼠体重)肝纤维化改良方法，与常规方法一样，在染毒4w时形成明显的肝纤维化，但大鼠死亡率较常规组显著降低；而且改良方法模型大鼠的肝细胞炎症坏死减轻，肝窦毛细血管化更为明显。
2.在肝纤维化的形成过程中，TGF-β1蛋白及mRNA及TβR-Ⅰ蛋白表达明显增加，TβR-Ⅱ蛋白表达变化不大；Smad2的磷酸化水平及Smad3的活性增强，即TGF-β/Smads信号转导的增强与肝纤维化发生发展密切相关。
3.丹酚酸B盐预防与干预用药能够明显减轻肝细胞的炎症坏死，减轻肝脏的胶原沉积，具有抑制肝纤维化的发生发展的作用；并且在炎症阶段干预用药作用较明显。
4.丹酚酸B盐抗肝纤维化的作用机制与抑制纤维化肝脏TGF-β1及其Ⅰ型受体的表达、下调Smad2与Smad3的活性，抑制TGF-β/Smads病理信号转导有关。
创新点：
1.改良传统的DMN肝纤维化造模方法，即在总用药时间及每次用药剂量不变的情况下，将既往每周连续3次腹腔注射改为每2天1次，结果发现该改良方法可显著降低模型大鼠死亡率；与传统方法一样，染毒4w形成明显的肝纤维化，但具有肝细胞炎症坏死稍轻与肝窦毛细血管化更为明显的病变特点。
2.发现肝纤维化过程中，肝组织Smad2磷酸化与Smad3核表达增加，TGF-β/Smads信号通路上调与DMN肝纤维化分子病理机制密切相关。
3.首次在肝纤维化不同病变阶段用药比较观察丹酚酸B的抗肝纤维化较佳用药时机(治疗窗口)，发现在炎症期用药作用较为明显。并且发现丹酚酸B盐抗肝纤维化的作用机制与下调纤维化肝脏TGF-β/Smads信号转导有关。