论文部分内容阅读
[目的] 杨梅中含有多种黄酮类化合物，从杨梅中分离、提纯得到的黄酮类化合物杨梅素(Myricetin，MYR)。近年来发现其具有抗氧化性、消除体内自由基、抗癌防癌、抗菌抗病毒、抗炎、防止血小板聚集等多种生物活性。但其对正常人黑素细胞的影响却鲜有报道。在黑素运输阻断剂的筛选中，我们发现杨梅素能够诱导正常人表皮黑素细胞的形态变化，抑制黑素细胞树突延伸。黑素在黑素细胞内合成后，经由黑素细胞树突分泌入周边角质化细胞内，形成皮肤色素并保护机体免受紫外线损伤，因此黑素转运率是影响肤色的重要因素。此过程受树突长短、树突分叉的数量及胞内外环境的影响。本研究旨在评价杨梅单体杨梅素及杨梅提取液对正常人表皮黑素细胞的细胞形态和增殖的影响，并阐明杨梅单体杨梅素及杨梅提取液对于人表皮黑素细胞黑素体合成与转移过程中的作用。 [方法] 采用M254黑素细胞培养基及添加剂HMGS培养和纯化人表皮黑素细胞；使用原子吸收光谱法测定新鲜杨梅的成分；醇提取法提取杨梅的活性成分；观察杨梅素及杨梅提取液对正常人黑素细胞的增殖和黑色素生成方面的调节作用；分别采用常规制样方法和以PET聚酯薄膜为培养细胞的支持物制备透射电镜样本，并通过透射电镜观察杨梅素及杨梅提取液对黑素细胞超微结构的影响；激光共聚焦显微镜观察杨梅素及杨梅提取液对黑素细胞相关蛋白Tyrosinase，TRP-1，Myosin Va和β-actin的表达的变化；实时定量PCR检测Tyrosinase，TRP-1，Myosin Va和Rab27a在基因水平上的表达的变化。 [结果] 1.本研究成功分离及纯化了人表皮黑素细胞，完善了人表皮黑素细胞体外培养条件。 2.原子吸收光谱方法测定杨梅的化学元素含量。 3.杨梅素对黑素细胞的增殖和黑素合成有一定的抑制作用；杨梅素作用组黑素细胞树突明显变短，树突分叉减少，且呈浓度依赖性。杨梅提取液对黑素细胞树突增生有一定的促进作用。 4.人表皮黑素细胞透射电镜观察发现，常规制样标本可观察人表皮黑素细胞及其树状突起横切面的超微结构。PET聚酯薄膜作为培养黑素细胞支持物的样本可观察人表皮黑素细胞和树状突起的完整超微结构及树状突起的纵切面超微结构。 5.透射电镜结果显示，Control组黑素细胞细胞核周围有较多的线粒体和Ⅰ、Ⅱ期黑素体，较多黑化的Ⅲ、Ⅳ期黑素体靠近细胞膜分布。50μM杨梅素作用48 h后黑素细胞细胞核周围有较多的线粒体和Ⅰ、Ⅱ期黑素体，仅有少量黑化的Ⅲ、Ⅳ期黑素体散在分布于细胞中。与Control组黑素细胞相比，杨梅提取液组黑素细胞的超微结构未见明显变化。 6.激光共聚焦显微镜检测发现，Control组黑素细胞Tyrosinase和TRP-1蛋白在树突顶端高表达；50μM杨梅素组，Tyrosinase和TRP-1蛋白在细胞内散在分布，与Control相比，Myosin Va蛋白在黑素细胞内表达下降。杨梅提取液组与Control组相比，黑素细胞内Myosin Va蛋白的表达无明显变化。 7.实时PCR检测发现，随着杨梅素作用浓度的增加，Tyrosinase、TRP-1、Myosin Va和Rab27a mRNA的表达呈先激活后抑制作用。50μM杨梅提取液时作用黑素细胞48 h后，Tyrosinase和Rab27a mRNA的表达呈被抑制作用。 [结论] 1.成功建立了体外原代培养的人表皮黑素细胞模型。 2.0～100μM杨梅素可诱导黑素细胞形态明显改变和抑制黑素细胞中黑素的合成，并且对黑素细胞无毒性。0～400μM杨梅提取液对黑素细胞无毒性。 3. PET聚酯薄膜可作为人表皮黑素细胞体外培养良好的支持材料。应用不同样本制备方法可以观察黑素细胞的超微结构，使用PET聚酯薄膜作为细胞支持物制备的标本更利于黑素细胞黑素体代谢和转移的观察。 4.电镜观察结果显示，杨梅素作用组黑素细胞黑素体的转运被抑制，黑素化程度降低。而杨梅提取液组黑素细胞无明显变化。 5.激光共聚焦显微镜检测结果显示杨梅素作用组黑素细胞Tyrosinase和TRP-1蛋白定位发生改变。Myosin Va蛋白在细胞内表达下降。杨梅提取液组与Control组相比，无明显变化。 6.实时PCR结果显示，随着杨梅素作用浓度的增加，杨梅素作用组黑素细胞Tyrosinase、TRP-1、Myosin Va和Rab27amRNA的表达呈先激活后抑制。在50μM杨梅提取液时作用条件下，黑素细胞Tyrosinase和Rab27amRNA的表达也被抑制。