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研究背景:肠杆菌科细菌是临床最为常见的机会性致病菌属之一,广布于人体肠道和医院环境中,可导致不同类型的感染。碳青霉烯类抗菌药物具有抗菌谱广、抗菌活性强和杀菌快速的特点。随着不断增高的抗生素选择压力,陆续出现碳青霉烯类抗生素耐药肠杆菌科细菌(Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae,CRE),将对人类生命健康产生前所未有的胁迫。CRE耐药机制主要为产KPC、NDM、VIM、IMP和OXA-48型碳青霉烯酶耐药基因,其中产NDM型碳青霉烯酶CRE可强效水解各种碳青霉烯类抗菌药物。碳青霉烯类耐药阴沟肠杆菌是目前CRE菌株中的研究热点。学者Miyoshi-Akiyama T等建立阴沟肠杆菌多位点序列分型方案,结合阴沟肠杆菌脉冲场凝胶电泳获取的高分辨率基因组酶解图谱,可充分认识碳青霉烯耐药阴沟肠杆菌的克隆传播机制。耐药质粒的可接合性使定位于质粒的耐药基因进行水平播散成为可能。因此,全面分析CRE菌株的耐药情况,了解CRE菌株对碳青霉烯类抗生素的耐药机制,探讨CRE的水平及克隆传播机制意义重大。研究目的:1.探讨2012～2016年武汉大学人民医院碳青霉烯类抗生素耐药肠杆菌科细菌的临床分布及耐药特点。2.探讨耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌的碳青霉烯酶表型及基因型。3.探讨碳青霉烯类耐药阴沟肠杆菌的克隆及水平传播机制。研究方法:1.分析2012年1月～2016年12月武汉大学人民医院分离鉴定CRE菌株的药敏信息,菌株采用BD PhoenixTM 100全自动细菌鉴定及药敏分析仪,通过生化反应鉴定菌株到种水平,同时采用微量肉汤稀释法对12种抗生素进行药敏实验,并且采用K-B(Kirby-Bauer)纸片扩散法补充药敏实验。2.采用CarbaNP实验确证碳青霉烯酶表型的体外存在情况,采用PCR法检测KPC、NDM、IMP、VIM和OXA-48等5种碳青霉烯酶基因,采用2.0%琼脂糖凝胶电泳PCR扩增产物,纯化产物测序,BLAST验证扩增产物基因亚型。3.采用质粒接合实验验证碳青霉烯类耐药阴沟肠杆菌的水平传播机制,采用MLST及PFGE实验验证耐药基因的克隆传播机制。4.药敏数据分析采用SPSS 21.0、Whonet 5.6、Excel 2013软件,PFGE数据采用BioNumerics软件,ST序列号通过阴沟肠杆菌MLST数据库获取。研究结果:1.本院CRE标本以痰液(114,42.9%)和尿液(94,35.3%)为主,菌株构成以肺炎克雷伯菌(155,58.3%)为主,科室分布以神经内科(56,21.1%)、ICU(43,16.2%)及神经外科(39,14.7%)为主。本院CRE对亚胺培南、美罗培南的耐药率分别为90.6%和87.6%,对其余β-内酰胺类抗生素的耐药率均高于92.8%,对阿米卡星和复方新诺明耐药率分别为46.4%和41.1%。2.88株碳青霉烯类抗生素耐药的肠杆菌科细菌中,CarbaNP实验阳性率为86.4%(76/88);携带NDM-1型耐药基因29株,阳性率为33.0%;携带KPC-2型耐药基因24株,阳性率为27.3%,两组比较差异无统计学意义(χ2=0.68,P>0.008);携带VIM-19型耐药基因9株,阳性率为10.2%,携带IMP-4型耐药基因为14株,阳性率为15.9%,两组比较差异无统计学意义(χ2=1.25,P>0.008)。未发现OXA-48基因;3株肺炎克雷伯菌同时携带KPC-2和NDM-1基因。3.9株碳青霉烯类抗生素耐药阴沟肠杆菌通过Carba NP实验检测阳性率为55.6%(5/9)。PCR及序列分析发现1株NDM-1型联合VIM-19型碳青霉烯酶,3株NDM-1型碳青霉烯酶,1株VIM-19型碳青霉烯酶。4株NDM-1型碳青霉烯酶阴沟肠杆菌的耐药质粒通过接合转入大肠埃希菌C600且受体菌均可在亚胺培南(4 ug/ml)和利福平(100 ug/ml)双抗平板上生长。MLST实验获得序列型分别为ST145、ST508和ST509。PFGE实验结果通过聚类分析发现4号和7号菌株的相似系数为92.3%,即为相同克隆株;和6号菌株的相似性系数为66.7%;和1号菌株的相似系数为59.9%,即分别为不同克隆株。研究结论:1.CRE在呼吸和泌尿系统感染中常见;临床医生应重点关注耐碳青霉烯类抗生素肺炎克雷伯菌的耐药情况;CRE在神经内科、ICU和神经外科病区的患者中常见;CRE对大多数抗生素耐药,阿米卡星和复方新诺明为目前本院对CRE相对敏感的抗生素。2.产碳青霉烯酶是CRE对碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因,耐药基因以NDM-1和KPC-2型为主,其次为IMP-4和VIM-19型,部分CRE菌株具有联合产碳青霉烯酶的特征。3.NDM-1型碳青霉烯酶是本院阴沟肠杆菌对碳青霉烯类抗生素耐药的重要基因型,NDM-1型和(或)VIM-19型碳青霉烯酶基因均可通过耐药质粒在菌种间接合水平传播;ST508、ST509和ST145分别为不同克隆株,呈散在克隆播散的特点,携带NDM-1耐药基因的ST509克隆株为本院潜在的优势克隆株。