【摘 要】
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烟曲霉是一种自然界中广泛分布的机会性致病真菌,是引起侵袭性曲霉病、过敏性支气管曲霉病的最主要病原体。尤其在器官、骨髓移植和艾滋病患者等免疫功能受抑制的人群中,烟曲霉的感染会造成较高的死亡率。近年来,由于免疫治疗的广泛使用,烟曲霉引起的感染在临床上日趋严重。目前用于治疗曲霉病的药物主要包括三大类:唑类药物,多烯类药物和棘白菌素类药物。唑类药物被认为是临床上治疗曲霉感染的一线药物,但近年来已发现越来越
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烟曲霉是一种自然界中广泛分布的机会性致病真菌,是引起侵袭性曲霉病、过敏性支气管曲霉病的最主要病原体。尤其在器官、骨髓移植和艾滋病患者等免疫功能受抑制的人群中,烟曲霉的感染会造成较高的死亡率。近年来,由于免疫治疗的广泛使用,烟曲霉引起的感染在临床上日趋严重。目前用于治疗曲霉病的药物主要包括三大类:唑类药物,多烯类药物和棘白菌素类药物。唑类药物被认为是临床上治疗曲霉感染的一线药物,但近年来已发现越来越多的临床分离株对唑类药物产生耐药性。多烯类和棘白菌素类药物虽然也能够有效治疗真菌感染,但其局限性在于药物对于人体的毒副作用较大。因此,当务之急是寻找并鉴定新型药物靶点以有助于开发新型抗真菌药物。本文将采用多学科的手段包括遗传学,细胞生物学,生物化学,X射线晶体学和基于分子片段的药物筛选技术,分别研究了:（1）参与细胞壁合成途径的磷酸甘露糖变位酶PmmA;（2）参与麦角固醇合成途径的乙酰辅酶A酰基转移酶Erg10A;（3）参与钙信号通路调控的棕榈酰转移酶AkrA能否成为潜在的新型抗真菌靶点。1)PmmA是GDP-甘露糖合成途径中的第二个酶,GDP甘露糖作为蛋白质糖基化中外层甘露糖的供体参与细胞壁的合成。我们假说认为缺失PmmA或者抑制该基因的表达,烟曲霉会因细胞壁合成受阻导致生长终止。本研究通过构建基因敲除和启动子表达可控的酒精启动子条件菌株,证实pmmA基因为烟曲霉的必需基因,可以作为潜在的药物靶点。当pmmA基因表达被抑制时（表达量约为野生型的50%,称为半抑制）,烟曲霉菌丝生长、孢子萌发、极性生长和生物膜形成都相应受到显著的抑制或降低;同时表现出对于细胞壁破坏试剂刚果红和卡泊芬净比野生型更高的敏感性。通过分析pmmA基因半抑制状态下菌株细胞壁各组分可知,p-葡聚糖的含量显著减少,同时,α-葡聚糖和几丁质成分增加。其次,通过生化和结构生物学手段,我们解析了烟曲霉PmmA蛋白的结构,发现PmmA蛋白在多种构象状态下的晶体结构,揭示其构象的灵活性。利用基于片段分子的药物筛选技术,通过筛选片段分子化合物库,我们鉴定出26种与PmmA亲和力在微摩尔级别的小分子片段。2)Erg10A是酵母中乙酰辅酶A酰基转移酶Erg10的同源蛋白,作为甲羟戊酸通路的起始酶,催化两个乙酰辅酶A分子脱水缩合形成乙酰乙酰辅酶A。我们采用遗传学和生物化学、结构生物学相结合的手段证明了烟曲霉中乙酰辅酶A酰基转移酶Erg10A可以作为潜在的药物靶点。我们同样采用遗传学手段证实erg10A基因为烟曲霉的必需基因。当erg10A基因处于半抑制状态时,菌株的菌丝生长、孢子萌发和极性生长受到严重的影响,说明定位在线粒体上的Erg10A在菌株的形态发生和极性维持方面扮演重要角色。另外,erg10A酒精启动子条件菌株在半抑制条件下由于细胞壁组分发生变化导致对细胞壁破坏试剂刚果红和Calcofluor white敏感性改变。此外,由于细胞内活性氧的积累,erg10A酒精启动子条件菌株在半抑制条件下还表现出对氧化应激的敏感性。通过生化和结构生物学手段,对比人类ACAT1和我们解析的烟曲霉Erg10A蛋白结构发现,在Erg1OA与底物CoA结合区周围的氨基酸与人类ACAT1存在明显差异。最后,我们通过基于片段分子的药物筛选技术,利用2个不同的分子片段库筛选到11种与Erg10A亲和力在微摩尔级别的小分子片段。3)AkrA是酵母中棕榈酰转移酶Akr1的同源蛋白,本文证明了 AkrA调节构巢曲霉钙离子稳态并在低钙环境中对菌丝生长和产孢起着重要的作用。利用水母发光蛋白系统,我们发现akrA突变体菌株对于高钙环境、内质网及细胞膜压力引起的胞内钙离子浓度变化方面存在缺陷。另外,还发现所有由AkrA引起的缺陷表型与AkrA自身棕榈酰化及AkrA蛋白中DHHC结构域上的半胱氨酸残基紧密相关。当敲除DHHC结构域或将半胱氨酸残基突变后,菌株对唑类药物的敏感性增加。同时,通过酰基生物素交换法,鉴定可能受AkrA修饰的底物蛋白。这其中包括钙离子信号系统相关蛋白和参与唑类药物抗性的麦角固醇合成通路相关蛋白。此外,烟曲霉在缺失AkrA的同源蛋白后显示出与构巢曲霉相似的缺陷表型,说明AkrA功能在烟曲霉中保守。综上所述,本文通过多种生物学手段阐明了曲霉PmmA、Erg10A和AkrA的生物学特征以及它们能否作为潜在药物靶点的系列探索性研究。本研究发现将对于抗真菌药靶的新药研发奠定强有力的理论基础。
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