荔枝芽休眠调控因子研究及转录组与蛋白组分析

来源 :华南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:lijizhong520
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芽休眠的调控是一个复杂的过程,在休眠的诱导、形成、保持、解除、恢复生长的过程中由多种因素共同调控,不同物种芽休眠的调控因素也不同。目前芽休眠的研究以落叶树为主,而热带常绿树种的芽休眠研究较少。根据荔枝(Litchi chinensis Sonn.)芽在生长-休眠的发育循环中芽的形态特征,我们将荔枝芽分为四个不同的状态:休眠芽(S1)、萌动芽(S2)、快速生长芽(S3)、生长停滞芽(S4)。本研究从芽调控的生理因素、转录组、蛋白组、分子调控等几方面对荔枝芽发育循环展开研究,主要研究结果如下:
  对荔枝顶芽进行遮阴处理能显著抑制顶芽的休眠解除,维持芽的休眠状态,表明芽萌动受到光照直接调控。进一步从荔枝克隆了4个光敏色素基因LcPHYA、LcPHYB、LcPHYC、LcPHYE,均在荔枝芽休眠和生长停滞时表达量高,在萌动期和快速生长期表达低。而遮阴处理下,4个光敏色素的表达量升高且高于对照组。
  荔枝新梢生长呈“S”型。部分叶片摘除不推迟芽的休眠,对新梢的节位数也没有影响,但新梢的总长度和节间长度变短;而将新梢上新叶持续全部摘除,芽推迟进入休眠状态,新梢的节位数也增加,但节间长度缩短。实验表明,新叶对节间伸长有重要作用,而且生长中的新叶对顶芽的持续生长起抑制作用。
  外源细胞分裂素可以促进荔枝顶芽萌动,但对已经萌动的芽继续处理外源细胞分裂素反而显著抑制芽的生长,促进侧芽发生。因此,细胞分裂素对萌芽表现正效应,而对萌芽后的芽生长起抑制作用。
  利用RNA-seq技术系统分析?妃子笑?荔枝4个不同状态的芽基因表达,4个荔枝样品测序共组装到59999个unigenes,40119个unigenes得到注释。在Nr、Swiss-Prot、COG、KEGG四个公共数据中都有注释的unigenes有9468个。S1与S2、S2与S3、S3与S4、S4与S1的差异基因分别为24080个、9481个、15838个、15968个,对阶段转变时上调和下调的基因分别进行GO功能富集,证明休眠的进入和解除可能涉及表观遗传调控。荔枝芽4个不同状态的差异表达的基因趋势分析分为26种,显著富集的趋势有9种,富集到激素信号转导、碳水化合物代谢、氧化还原酶、细胞周期、生物钟等途径。利用主成分分析,找到了17个主效基因,大多数在芽休眠和生长停滞中上调表达,多与营养储备和抗逆相关。对其中8个基因的表达量进行Real-time qPCR分析,表达趋势与转录组测序获得的基因表达趋势相似,两种分析的相对基因表达量具有显著的线性相关性。
  Dormancy-asscoiated MADS-BOX genes(DAM基因)基因是一类休眠相关基因,DAM基因属于MADS-BOX的SVP亚族。从荔枝中克隆到3个SVP类基因:LcSVP1、LcSVP2、LcSVP3,它们都具有典型的MADS-BOX蛋白功能域,与龙眼SVP亲缘关系最近。它们在不同组织中都有表达,其中,LcSVP1、LcSVP2在成熟叶中表达量最高,LcSVP3在嫩叶中表达量最高,三者均在花器官中表达量均比较低。LcSVP1、LcSVP2的表达变化与芽休眠一致,在休眠芽和生长停滞芽中表达量高,在萌动芽和快速生长芽中表达量低。LcSVPs的启动子区域具有多个光调控的顺式元件,但对荔枝休眠芽(S1)进行遮阴处理,LcSVP2的表达上升,对LcSVP1表达无显著影响。利用VIGS技术沉默LcSVP2的荔枝芽生长期延长,休眠推迟,节位数增多,且伴随LcFT2表达量明显提高。LcSVP1、LcSVP2都定位在细胞核中。LcSVP1、LcSVP2转烟草进行转录活性分析,结果表明LcSVP1、LcSVP2均为转录抑制调控的转录因子。
  利用iTraq技术对?妃子笑?荔枝4个不同状态的芽蛋白含量分析,荔枝芽鉴定的蛋白质(Protein)数量为3999个,荔枝芽蛋白组注释到KEGG pathway的蛋白数为1181个。S1与S2、S2与S3、S3与S4、S4与S1分别有306、294、371、165个差异蛋白。差异蛋白最多的为休眠芽S1与快速生长芽S3,有767个差异蛋白。而休眠芽S1与生长停滞芽S4的差异蛋白最少。荔枝芽的四个不同阶段中有含量变化的290个蛋白分为26种趋势。显著富集(P-Value<0.05)的趋势有5种,显著富集的pathway有黄酮类生物合成、光合作用、碳代谢等生化途径。荔枝芽转录组与蛋白组相关性较弱,显示基因转录后翻译为蛋白的过程存在大量的转录后调控。
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