【摘 要】
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Pseudomonas syringae pv. pisi和Pseudomonas syringae pv. maculicola分别为豌豆细菌性疫病和十字花科细菌性黑斑病的致病菌,在我国均被列入《中华人民共和国进境植物检疫
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Pseudomonas syringae pv. pisi和Pseudomonas syringae pv. maculicola分别为豌豆细菌性疫病和十字花科细菌性黑斑病的致病菌,在我国均被列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。本研究自主设计了针对这两种病菌的特异性引物,建立了一套可靠、灵敏、快捷的分子检测方法,有望从源头上协助控制两种检疫性病菌的扩散,为我国的植物检疫提供技术支撑。本研究以150株包括两种靶标菌在内的植物相关细菌为模板进行了常规PCR扩增,结果表明两对特异性引物均没有出现假阳性和假阴性。灵敏度测试结果表明常规PCR测定豌豆细菌性疫病菌纯化DNA的检测限为103fg/μl,菌悬液的检测限为102CFU/ml实时荧光定量PCR测定纯化DNA的检测限可达102fg/μl,菌悬液的检测限达10FU/ml。豌豆模拟带菌活体样本的检测中,特异性引物能够分别从植物粗提物的102倍(常规PCR)、103倍(实时荧光定量PCR)稀释液中检测到靶标细菌。以十字花科细菌性黑斑病菌的纯化DNA及菌悬液梯度稀释产物为模板进行的灵敏度测试中,常规PCR以及实时荧光定量PCR的检测限均为102fg/μl和10CFU/ml。在模拟种子带菌的检测中,常规PCR对经种子浸泡液稀释过的菌悬液的检测限为105CFU/ml,实时荧光定量PCR的检测限为103CFU/ml。模拟带菌种子抽样检测的结果表明,常规PCR可以检测出带菌率为5%的种子样本(即10g种子中含0.5g带菌种子),而实时荧光定量PCR可以检测出带菌率为2.5%的种子样本(10g种子中含0.25g带菌种子)。本研究通过对检测样本中的靶标菌进行富集培养后再进行检测,大大提高了检测精度,结果表明常规PCR和实时荧光定量PCR均可检出千分之一带菌率的种子。
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