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目的:
龋齿是人类最常发生的细菌感染性疾病,其发病率较高,易感人群广,对人类健康影响极大。变异链球菌(Streptococcus mutans)是目前公认的导致龋齿的致病菌之一和感染性心内膜炎的原发病原体。研究表明,变异链球菌的致病性跟其自身所携带的毒力因子有密切的关系。变异链球菌UA159基因组中ilvE基因编码的支链氨基酸转移酶能够提高变异链球菌的耐酸性,从而提高细菌在低pH条件下的生存能力和致龋能力。但到目前为止,变异链球菌支链氨基酸转移酶(BCAT)的结构尚未解析,因此,希望能够通过解析BCAT的三维结构对变异链球菌的致病机制有进一步的了解,为龋齿治疗和新药开发寻找新思路。
方法:
1)重组质粒的构建及鉴定根据GenBank中S.mutansUA159株的全基因组序列,设计特异性引物,扩增编码BCAT的DNA序列,将其克隆至pGEX-6P-1表达载体中,构建GST融合蛋白的重组质粒。
2)BCAT的诱导表达与纯化将测序正确的重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达,然后用亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤纯化目标蛋白,用SDS-PAGE和质谱分析纯化的目标蛋白。
3)重组BCAT蛋白的活性测定使用谷氨酸测定试剂盒测定了重组BCAT的生物学活性。
4)BCAT的结晶与结构解析使用Hampton Research公司的晶体生长试剂盒对纯化好的蛋白进行晶体生长条件筛选,对初筛生长条件进行优化,得到适于X光衍射的单晶,通过同步辐射加速器收集晶体衍射数据,借助于CCP4等一系列蛋白结构解析软件进行结构解析。
结果:
1)BCAT能够在大肠杆菌中高效、可溶性表达,经SDS-PAGE分析,目标蛋白的分子质量与预期大小一致,经质谱鉴定,所表达的目标蛋白为变异链球菌UA159株的BCAT。
2)通过对BCAT表达及纯化条件的优化,建立了一种纯化BCAT蛋白的方法,纯化后的目的蛋白纯度可达98%以上,适于进行蛋白晶体的生长。
3)纯化后的目的蛋白具有氨基转移酶的生物学活性,对各种氨基酸底物的比活如下:Ile>Leu>Val>Trp>Gly.
4)使用Hampton Research公司的晶体生长试剂盒对晶体生长条件进行筛选,筛选出适合BCAT蛋白晶体的生长条件并对其进行了优化,得到适于衍射数据收集的晶体。
5)在上海同步辐射光源收集晶体衍射数据,BCAT蛋白晶体衍射最高可达1.97A,用分子置换法成功解析了BCAT的结构,并对结构与功能的关系进行了分析。
结论:
本研究成功地在大肠杆菌中高效表达了变异链球菌BCAT蛋白,建立和优化了完善的纯化方法,确定了其生物学活性并成功解析了BCAT的结构。