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在植物长期进化过程中,MAPK信号级联途径(Mitogen-activated protein kinasepathway)在将细胞外信号刺激转导至细胞内从而引起相应的生理生化反应的过程中起着重要的枢纽作用。目前许多研究表明,MAPK级联信号途径广泛参与干旱、高盐等多种非生物胁迫及病原体侵染等生物胁迫信号途径,但目前大多数研究集中于拟南芥等模式生物中,对于经济作物棉花中的研究较少。另外,不同植物中的同源基因或者相同植物中同一家族的不同基因其生物学功能也具有一定的差异性。所以,借鉴已有的模式植物中相关同源基因的生物学功能研究,进而对重要的经济作物中相关基因的研究具有一定的必要性。棉花是世界性的纤维及油料作物,在我国是除粮食以外的重要经济作物之一,具有重要的经济价值。
本研究以陆地棉(Gossypium hirsutum L.)(鲁棉22)为研究材料,利用同源克隆的方法克隆获得两个MAPK基因,对其分别进行了序列分析、表达模式分析及生物学功能鉴定等,研究结果如下:
(1)通过同源克隆的方法获得两个MAPK基因。通过基因全序列测定及进化树分析表明,同源克隆所获得基因分别为MAPK A亚组和D亚组基因,依据基因同源性将两基因分别命名为GhMPK6a和GhMPK20。亚细胞定位分析表明两者均定位于细胞质和细胞核中。因此推测两者可能在细胞质和细胞核中发挥相应的生物学功能。
(2)对GhMPK6a和GhMPK20在棉花中的表达模式进行研究表明,GhMPK6a和GhMPK20的转录水平可受高盐、机械损伤、干旱和冷等非生物胁迫;脱落酸(Abacissicacid,ABA)、乙烯(Ethylene,ET)、茉莉酸(Jasmonate,JA)等多种信号分子及青枯细菌的诱导,说明两基因可能分别参与多种信号通路。
(3)分别构建了两基因的正义植物表达载体,并通过农杆菌侵染的方法获得GhMPK6a和GhMPK20转基因本生烟植株,对两者的转基因本生烟植株进行生物学分析表明,转基因植株均对非生物胁迫干旱和高盐的敏感性增强。另外,GhMPK6a转基因植株对生物胁迫青枯细菌的侵染也表现一定的敏感性。通过IR-PCR的方法分别获得GhMPK6a和GhMPK20的启动子序列后,通过软件分析及GUS活性分析表明GhMPK6a与生长发育具有一定的相关性。GhMPK20的启动子序列分析及过表达GhMPK20的转基因植株的生长表型表明GhMPK20也与生长发育有关。
(4)通过酵母双杂交的方法,证实所获得GhMKK4能够与GhMPK6a和GhMPK20互作。另外,通过双分子荧光互补实验进一步证实GhMKK4能够与GhMPK6a和GhMPK20在细胞质和细胞核中互作,说明GhMKK4为GhMPK6a和GhMPK20的上游激活基因。