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有机磷农药占世界农药总量的80％,其中甲基对硫磷(methylparathion,MP)等高毒农药占总农药用量的一半以上。这些农药都是胆碱酯酶抑制剂,对人具有较高的毒性。甲基对硫磷等在水解酶的作用下水解产生对硝基苯酚(para-nitrophenol,4NP,PNP),在这个过程中其毒性虽有降低,但是因为对硝基苯酚很强的水溶性,其造成的环境污染和对人畜的危害更严重。因此,有机磷农药降解的研究往往和对硝基苯酚的降解紧密联系。单硝基酚化合物(包括2-硝基酚,3-硝基酚,4-硝基酚)作为硝基酚类化合物中的一类,其结构简单,并且具有毒性和高度水溶性,在环境中易传播易积累,已被美国国家环保总局(EnvironmentalProtectionAgency,EPA)列为优先控制污染物。目前研究报道的硝基酚化合物代谢途径多样,并且在多种菌属中发现。
然而,自然界中分离到的能够同时降解邻硝基酚(ortho-nitrophenol,2NP、ONP)、PNP的微生物仅有2株,并且对其降解的分子背景还不了解。虽然已有构建出能同时降解邻硝基酚和对硝基酚的工程菌,但是采用的是转入含有onpAB基因(邻硝基酚单加氧酶基因和邻苯二醌还原酶基因)降解质粒,该菌在不含抗性的培养基多次传代后,转入的降解质粒会逐渐丢失。因此,有必要构建出不含抗性基因且稳定遗传能同时降解这些污染物的工程菌。
本研究是根据已有的代谢途径,即来自甲基对硫磷降解菌Pseudomonassp.WBC-3中的甲基对硫磷水解酶(MPH)能作用MP生成PNP；而对硝基酚降解菌Pseudomonassp.NyZ402是一株PNP降解菌并且该菌也能利用邻苯二酚；Alcaligenessp.NyZ215是一株ONP的降解菌,该菌在邻硝基酚单加氧酶和邻苯二醌还原酶(ONP2-monooxygenasegeneando-benzoquinonereductase,OnpAB)的作用下,氧化ONP至中间代谢物邻苯二酚,接着邻苯二酚开环后进入三羧酸循环(citricacidcycle,TCA)彻底降解。利用染色体整合自杀载体pEXl8Tc,将菌株WBC-3中甲基对硫磷水解酶基因(mph)重组至菌株NyZ402的非必需基因pnpAl上,构建出不含抗性标记、稳定共降解甲基对硫磷、对硝基酚的菌NyZ-M；用同样的方法将菌株NyZ215中onpAB基因及mph基因整合至菌株NyZ402中非必需基因pnpAl上,使得菌株NyZ215和菌株NyZ402代谢途径加以整合,构建出不含抗性标记、稳定共降解甲基对硫磷、邻硝基酚的菌NyZ-MO。将NyZ-MO在不含抗性的LB平板上连续传代30代后,甲基对硫磷水解酶和邻硝基酚单加氧酶活性仍然保留,表明插入的基因是能100％稳定遗传的并且是组成型表达的。降解实验表明,NyZ-M能在19小时彻底降解0.2mM的MP。NyZ-MO能分别彻底降解0.2mM的MP,0.2mM的ONP或者0.1mMMP-0.1mMONP。
该论文的创新和特点是:1.首次获得了能同时降解甲基对硫磷、对硝基酚和邻硝基酚3种污染物的降解菌；2.该降解菌不含抗性标记,解决了基因工程菌的带来的安全性问题；3.外源降解基因插入受体菌染色体中,从而达到稳定遗传。