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多糖是中华被毛孢最重要的活性成分之一,具有很好的生物学活性。多糖对组织细胞几乎没有毒副作用,因此多糖有十分良好的应用前景。木论文的主要研究对象为中华被毛孢菌多糖(HSP-Ⅲ),中华被毛孢是冬虫夏草无性繁殖的菌丝体。实验主要考察HSP-Ⅲ对肺癌细胞(H1299)的增殖、凋亡以及体外迁移能力的影响。通过PDA固体培养基培养对菌种进行活化,通过液体发酵培养对中华被毛孢进行扩大培养。采用热水提取、乙醇沉淀法得到中华被毛孢粗多糖HSP- Ⅰ ;除去粗糖中(HSP-Ⅰ)蛋白采用了 Sevage法,得到HSP-Ⅱ;采用SephadexG-100柱层析纯化后得到大分子多糖HSP-Ⅲ,得率分别为12.60%、5.43%和0.93%。采用MTT法检测H1299细胞的体外增殖能力。发现HSP-Ⅲ能抑制H1299细胞的增殖的作用。通过免疫荧光、Western blot和RT-PCR检验了细胞增殖标志物PCNA蛋白,发现HSP-Ⅲ会使H1299细胞PCNA的表达量降低,说明H1299细胞的增殖能力受到了抑制。对H1299细胞凋亡情况的影响,实验采用光镜观察、TUNEL和JC-1检测细胞凋亡,发现在有HSP-Ⅲ作用于H1299细胞的情况下,细胞的凋亡程度显著加重,HSP-Ⅲ可以促进H1299细胞的凋亡。采用划痕实验和Transwell检测H1299细胞的体外迁移能力。实验结果显示H1299细胞划痕的缩短距离没有显著差异,而且穿过膜泡的细胞数量也基本一致。采用了 Rh123(罗丹明123)、Western blot,研究HSP-Ⅲ的作用机理。结果表明当有HSP-Ⅲ作用于H1299细胞时线粒体中的膜电势有显著的降低,Bax蛋白量升高,细胞质基质中的细胞色素C的蛋白量升高,caspase家族蛋白被激活。从这些实验结果的数据可以得出:HSP-Ⅲ是通过线粒体调往途径发挥作用(如图4所示)。为了验证HSP-Ⅲ是通过线粒体凋亡通路影响H1299细胞的,实验中还采用了 DCFH-DA分子探针和Blue Native PAGE法检测线粒体中ROS (活性氧)和线粒体中各呼吸链复合物的变化。实验结果表明当有HSP-Ⅲ作用于H1299细胞时,线粒体受到损伤,证实了线粒体凋亡通路。实验中采取对免疫缺陷鼠皮下造瘤的方法模拟肿瘤的体生长形态,进而采取肿瘤瘤内注射HSP-Ⅲ药物,使HSP-Ⅲ对肿瘤发挥作用。实验结果显示在HSP-Ⅲ处理下,肿瘤的生长速度会变慢,肿瘤体积减小,肿瘤的重量变轻。证实HSP-Ⅲ在体内环境也有很好的抑制H1299细胞生长的效果。