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本文拟探讨NF-κB对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖转运蛋白(GLUT1和GLUT4)的表达以及葡萄糖摄取的影响。研究内容分为以下两个部分：
第一章NF-κB对高糖诱导的3T3-L1脂肪细胞葡萄糖转运蛋白的表达以及葡萄糖摄取的影响。
研究目的：观察高糖对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖转运蛋白(GLUT1和GLUT4)mRNA与蛋白的表达水平以及葡萄糖摄取的调节作用，并探讨NF-κB对上述调节作用的影响。
研究材料与方法：
1.3T3-L1前脂肪细胞培养、诱导分化及鉴定。
2.实验分组取第3～6代3T3-L1前脂肪细胞进行实验。按照上述方法诱导3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞后，用含1％FBS的DMEM培养液(D-葡萄糖浓度为5.6mmol/L)同步化24小时，然后分3组进行下列干预48小时，每24小时换相应处理液。
A组：低葡萄糖组(Lowglucose，LG)：DMEM中D-葡萄糖浓度为5.6mmol/L。
B组：高葡萄糖组(HG)：DMEM中D-葡萄糖浓度为25mmol/L。
C组：高糖+吡咯烷二硫氨基甲酸酯(pyrrolidinedithiocarbamate，PDTC)组(HG+PDTC)：先用含100μmol/LPDTC的DMEM培养液(D-葡萄糖浓度为5.6mmol/L)处理细胞30分钟，再用高糖DMEM培养液处理细胞48小时。
3.NF-κB活性检测(n=4)。
提取细胞总蛋白，经BCA法进行蛋白定量后，再以蛋白质印迹法(Westernblot)来半定量测定Phospho-NF-κBp65(Ser536)蛋白水平，以β-actin为内参照以AlphaImager2200软件分析电泳条带感光密度，并进行积分处理。
4.GLUT1和GLUT4mRNA水平的检测(n=6。
5.GLUT1和GLUT4蛋白水平的检测(n=4)。
6.氚标记的脱氧葡萄糖摄取率([3H]-2-deoxyglucoseuptake，2-DG)的检测(n=6)。
7.统计学分析应用SPSS11.0软件进行统计学分析。各组正态分布的数据或经转换后呈正态分布的数据以均数±标准差的方式表示，进行单因素的方差分析(One-wayANOVA)，两组间比较采用最小有意义差异(leastsignificantdifference，LSD)t检验。显著性水准α为0.05。
实验结果：
1.3T3-L1前脂肪细胞培养、诱导分化及鉴定。
3T3-L1前脂肪细胞呈贴壁生长，3～4天长至瓶底70％～80％，呈梭形或多角性，细胞核居中。经诱导分化6～8天后细胞变成圆形，细胞核偏于细胞一侧，细胞浆中可见折光性强的脂滴聚集。油红O染色鉴定可见成熟脂肪细胞胞浆内的脂滴被染成红色，细胞核被苏木素染成蓝色；而前脂肪细胞胞浆内无红色脂滴，仅见蓝色细胞核。
2.各组3T3-L1脂肪细胞间NF-κB活性的比较(各数据值×10-2)。B组(41.34±1.72，P＜0.001)高于A组(24.31±2.49)，C组(20.42±3.54，P＜0.001)低于B组，C组与A组之间的差别无统计学意义(P=0.071)。
3.各组3T3-L1脂肪细胞间GLUT1mRNA和蛋白水平的比较。
4.各组3T3-L1脂肪细胞间GLUT4mRNA和蛋白水平的比较。
5.各组3T3-L1脂肪细胞间葡萄糖摄取率的比较(单位：dpm/g×103)。
(1)基础葡萄糖摄取率：B组(218.78±101.61，P=0.003)低于A组(475.70±86.07)，C组(433.99±167.20，P=0.009)高于B组，C组和A组间的差别均无统计学意义(P=0.567)。
(2)胰岛素刺激葡萄糖摄取率：B组(456.03±132.33)和A组(396.78±172.31)比较有升高的趋势，但两组间的差别无统计学意义(P=0.462)。C组(287.83±90.50)低于B组(P=0.049)，C组和A组间的差别均无统计学意义(P=0.185)。
研究结论：
1.在3T3-L1脂肪细胞中，高浓度葡萄糖(25mmol/L)处理48小时能够激活NF-κB，而PDTC能够有效抑制高糖所诱导的NF-κB的活化。
2.在3T3-L1脂肪细胞中，高糖下调GLUT1基因和蛋白的表达，并抑制基础葡萄糖摄取，抑制NF-κB的活化后可逆转上述反应，提示NF-κB可能介导高糖的上述作用。
3.在3T3-L1脂肪细胞中，高糖上调GLUT4基因和蛋白的表达，抑制NF-κB的活化后可逆转上述反应，并使胰岛素刺激的葡萄糖摄取降低，提示NF-κB可能介导高糖的上述作用，而且NF-κB可能通过上调GLUT4基因和蛋白的表达而增加胰岛素刺激的葡萄糖摄取。
第二章NF-κB对TNF-α诱导的3T3-L1脂肪细胞葡萄糖转运蛋白的表达以及葡萄糖摄取的影响
研究目的：观察TNF-α对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖转运蛋白(GLUT1和GLUT4)mRNA与蛋白水平的表达以及葡萄糖摄取的调节作用，并探讨NF-κB对此调节作用的影响。
研究材料与方法：
1.3T3-L1前脂肪细胞培养、诱导分化及鉴定(同第一章)
2.实验分组
取第3～6代3T3-L1前脂肪细胞进行实验。按照上述方法诱导3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞后，用含1％FBS的DMEM培养液(D-葡萄糖浓度为5.6mmol/L)同步化24小时，然后分3组进行下列干预48小时，每24小时换相应处理液。以下三组均以DMEM(D-葡萄糖浓度为25mmol/L)培养液培养。
A组：对照组(Control)。
B组：TNF-α组(TNFα)：5nmol/LTNF-α处理细胞48小时。
C组：TNF-α+PDTC组(TNFα+PDTC)：
1.采用含100μmol/LPDTC(D-葡萄糖浓度为5.6mmol/L)处理细胞30分钟。
2.采用含5nmol/LTNF-α处理细胞48小时。
3.NF-κB活性检测(n=4)(同第一章)
4.GLUT1和GLUT4mRNA水平的检测(n=6)(同第一章)
5.GLUT1和GLUT4蛋白水平的检测(n=4)(同第一章)
6.氚标记的脱氧葡萄糖摄取率的检测(n=6)(同第一章)
7.统计学分析(同第一章)
实验结果：
1.3T3-L1前脂肪细胞培养、诱导分化及鉴定(同第一章)。
2.各组3T3-L1脂肪细胞间NF-κB活性的比较(各数据值×10-2)B组(71.11±5.94，P＜0.001)高于A组(41.34±1.72)，C组(25.38±4.69，P=0.001)低于A组，C组低于B组(P＜0.001)。
3.各组3T3-L1脂肪细胞间GLUT1mRNA和蛋白水平的比较：
4.各组3T3-L1脂肪细胞间GLUT4mRNA和蛋白水平的比较：
(1)GLUT4mRNA：B组(0.86±0.14，P＜0.001)低于A组(2.01±0.65)，C组(0.46±0.12，P＜0.001)低于A组。C组与B组比较有下降的趋势，但差别无统计学意义(P=0.100)。
(2)GLUT4蛋白(各数据值×10-2)：B组(31.63±7.18，P＜0.001)低于A组(60.69±8.44)，C组(9.52±2.95)分别低于A组(P＜0.001)和B组(P=0.001)。
5.各组3T3-L1脂肪细胞间葡萄糖摄取率的比较(单位：dpm/g×103)(1)基础葡萄糖摄取率：A组(218.78±101.61)与B组(228.45±84.98)差别无统计学意义(P=0.853)，C组(433.90±79.23)分别高于A组(P=0.001)，和B组(P=0.001)。
(2)胰岛素刺激葡萄糖摄取率：B组(383.83±117.88)和A组(456.03±132.33)比较有下降的趋势，但两组间的差别无统计学意义(P=0.256)。C组(162.77±46.65)分别低于A组(P＜0.001)和B组(P=0.003)。
研究结论：
1.在3T3-L1脂肪细胞中，TNF--(5nmol/L)处理48小时能够激活NF-κB，而PDTC能够有效抑制TNF-α所诱导的NF-κB的活化。
2.在3T3-L1脂肪细胞中，TNF-α不影响GLUT1基因和蛋白的表达以及基础葡萄糖摄取，抑制NF-κB的活化后GLUT1基因和蛋白的表达以及基础葡萄糖摄取均上升，提示NF-κB可能抑制GLUT1的表达以及基础葡萄糖摄取。
3.在3T3-L1脂肪细胞中，TNF--抑制GLUT4基因和蛋白的表达，抑制NF-κB活化后GLUT4蛋白的表达以及胰岛素刺激的葡萄糖摄取均进一步下降，提示NF-κB可能不参与TNF-α对GLUT4基因和蛋白表达的抑制作用，NF-κB可能上调GLUT4蛋白的表达以及胰岛素刺激的葡萄糖摄取。