论文部分内容阅读
漆酶是氧化酶,在污染物降解转化以及生物燃料电池研发方面有着重要的应用价值。漆酶的蛋白属性使得提高漆酶的活性和稳定性成为上述领域中的关键之一。介质调控是改善酶催化性能的策略之一,寻找适合漆酶活力表达的介质或微环境能促进漆酶在生物催化转化领域中的应用。水溶液是漆酶活力表达的重要场所。离子液体作为新兴的介质具有挥发性小、性质可调、对很多物质有良好的溶解性等优势,它能改善水溶液中某些酶的催化性能。对于给定的酶(漆酶),系统研究不同离子液体对其催化活性的影响并与酶构象关联,能为理性选择合适的离子组合构建漆酶的兼容性介质提供理论指导。反胶束是酶促疏水底物转化的理想介质。漆酶在反胶束中的催化活性有待提高,后者又依赖于反胶束的大小及其界面性质。金属纳米粒子具有结构刚性、形貌与尺寸可控等特点,利用金属纳米粒子来改变酶蛋白与表面活性剂界面的相互作用有助于对反胶束中漆酶催化性能进行调控。相比于反胶束,双连续微乳液能提供更大的界面面积和更小的传质阻力,是很有前景的酶反应介质。以双连续微乳液作为酶反应介质的报道不多且局限性于传统油/水/表面活性剂体系。以疏水离子液体代替传统油相构建离子液体基双连续微乳液作漆酶反应介质是一个新尝试。基于上述背景,本文尝试开展了如下几方面工作：1.水溶液中离子液体对漆酶催化性能的调控研究离子液体与酶的作用机制很复杂。对给定的酶,不同阴阳离子及其组合对酶的活性及稳定性影响不一样。我们以2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)为底物研究了漆酶在三种水溶性离子液体1-丁基-3-甲基咪唑三氟甲磺酸盐([Bmim]TfO)、N,N-甲基丁基吡咯三氟甲磺酸盐([Bmpyr]TfO)、四甲基铵三氟甲磺酸盐([TMA]TfO)中的活性和放置稳定性变化。用荧光和圆二色光谱跟踪离子液体对漆酶构象的影响。结果发现高浓度[Bmim]TfO和[Bmpyr]TfO对漆酶有抑制和去稳定化作用,随孵育时间的延长这种作用更明显。相反,[TMA]TfO是漆酶的稳定剂,当该离子液体浓度为1.0 M时,放置5天后漆酶残余活力为初始活力的90%以上(对照实验为40%)。离子液体对漆酶稳定性的影响与它们在Hofmeister序列中的阳离子顺序有关。对漆酶而言,[TMA]TfO不是激活剂,却是好的稳定剂。它能提高漆酶放置稳定性的同时能保持漆酶的催化效率不变。上述研究为系统探讨离子液体对漆酶的影响及其机制,探求适宜于漆酶催化的生物兼容性离子液体提供了理论依据。2.反胶束中金纳米粒子对漆酶催化性能的调控研究反胶束的界面性质是影响酶催化活性的重要因素。在反胶束中添加金属纳米粒子有可能会调控酶与界面的相互作用进而调控酶活性。对不同电性质的反胶束而言,相同的纳米材料对不同的酶可能会带来不一样的调控作用。本文用柠檬酸钠还原的方法制备了不同粒径的单分散的金纳米粒子(GNP)并研究了AOT阴离子反胶束中GNP对漆酶催化活性的影响。结果发现,尽管GNP在水溶液中对漆酶的活性和构象影响很小,但却能明显改变反胶束中漆酶的催化活性。GNP掺杂的反胶束中漆酶活力依赖于GNP的浓度、粒径、水含量及AOT的浓度。GNP加入反胶束后,表而活性剂分子在GNP周围重新聚集形成新的反胶束,这些胶束与空的反胶束共存且各种胶束的比例受GNP和AOT浓度控制。荧光探针技术和动态光散射技术证明了GNP掺杂的反胶束的存在。漆酶的荧光和圆二色光谱表明,GNP通过改变反胶束结构来调控漆酶活力,反胶束水层厚度及AOT独占面积是影响漆酶活性的主要因素。上述研究拓展并深化了对反胶束中酶催化活性的GNP调控机制的认识,为漆酶最佳微环境的设计提供了理性指导。3.疏水离子液体基双连续微乳液中漆酶催化性能的介质效应3.1新型双连续微乳液的构建与漆酶动力学研究疏水离子液体基双连续微乳液集离子液体与双连续微乳液优势于一体,是很有前景的酶反应介质。利用鱼形相图法,本文选用聚氧乙烯型非离子表面活性剂,系统研究了表面活性剂、助醇、疏水离子液体对微乳液相行为的影响。结果表明,表面活性剂聚氧乙烯单元数越少、助醇(C5-C10)浓度越高、疏水离子液体的Gordon参数值越小,微乳液体系的相转变温度(个)和表面活性剂效率越低。表面活性剂在疏水离子液体中的溶解／聚集、醇的界面效应及助溶剂效应是影响相行为的主要原因。基于上述对相行为的认识,本文选择了适当的微乳液体系研究了漆酶的动力学参数的组成依赖效应和温度效应。结果表明,助醇和温度是影响漆酶催化性能的重要参数。常温下,酶活力表达所需的最优助醇链长及浓度依赖于微乳液中疏水离子液体的类型。在所选的微乳液体系中,[Omim]NTf2/缓冲液/CnEm/1-己醇微乳液比较适合作漆酶反应介质；35.0℃时,在由C16E10稳定的上述双连续微乳液中漆酶的催化效率(95.3 mM-1min-1)是水饱和的[Omim]NTf2中漆酶催化效率(0.607mM-1min-1)的157倍。这是第一篇构建疏水离子液体基双连续微乳液作酶反应介质的报道。3.2普通醇和氟碳醇对微乳液相行为及漆酶催化性能影响的对比研究醇作为一种重要的助剂在微乳液的形成与结构调控方面有重要的作用。首次对比研究了中短链长(C2-C5)的普通醇和氟碳醇对聚氧乙烯型非离子表面活性剂稳定的疏水离子液体基双连续微乳液相行为及其增溶漆酶催化性能的影响。相行为研究表明：氟碳醇的(C2-C5)烷基链长越短、浓度越高,T越低；这一趋势与中长链长的普通醇(C5-C10)的影响规律相同。但普通醇对鱼尾坐标的影响则比较复杂,短链醇(C2-C3)的烷基链越短、浓度越高,体系的T越高。上述差异与普通醇和氟碳醇性质的显著差异有关。研究过程中还发现,氟碳醇和普通醇对体系相行为影响的差异依赖于疏水离子液体的组成。这一现象与助醇对疏水离子液体相性质的影响不同有关,后者决定了表面活性剂在疏水离子液体中的溶解和聚集,进而导致不同醇存在时,体系的T随疏水离子液体组成变化的不同。35.0℃下漆酶动力学研究表明,普通醇体系中,漆酶在1—戊醇/C12E10/缓冲液/[Omim]PF6体系中的催化效率最高(124.3 mM-1min-1);而氟碳醇体系中,1H,1H-三氟乙醇/C12E10/缓冲液/[Omim]PF6双连续微乳液更适合漆酶活力的表达,漆酶在其中的催化效率可达169.0 mM-1min-1。总体来说,1H,1H-三氟乙醇比其他醇在构建适合漆酶活力表达的双连续微乳液介质方面更具优势。