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目的:本研究通过全基因组表达谱检测、网络药理学数据分析和实验验证相结合的方法,探究海藻玉壶汤(HYD)治疗大鼠缺碘型甲状腺肿大的作用机制,并揭示海藻-甘草反药组合在此过程中的作用特点及其可能的作用机制,为中药复方的研究提供一种新的研究思路和方法。方法:第一部分全基因组表达谱芯片检测1缺碘型甲状腺肿大大鼠动物模型1.1动物分组SPF级Wistar大鼠20只,雌雄各半,体重160-180 g。按照随机均衡的原则,将其随机分为空白组、模型组、海藻玉壶汤(HYD)组、去海藻(Non-HZ)组和去甘草(Non-GC)组,每组4只,适应性饲养2天。1.2造模及给药除空白组外,其余各组灌服丙硫氧嘧啶(PTU)0.01 g/(kg.d),造模14天后开始给药,其中空白组与模型组给予生理盐水灌胃,HYD组、去海藻和去甘草组则给予相应药液灌胃,给药量0.9 g/(kg.d),连续给药28天。每周称重1次,自由摄食饮水。1.3样本采集造模结束后,各组大鼠眼眶取血,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)方法检测血清中T3、T4、TSH的含量。给药结束后,各组大鼠腹主动脉取血,采用上述方法检测血清中T3、T4、TSH的含量,此外,取甲状腺组织,待全基因组表达谱芯片检测。2各组大鼠甲状腺组织全基因组表达谱芯片检测采用基因表达谱芯片(ROA2.1)技术,检测各组大鼠甲状腺组织的基因表达谱,并进行差异表达数据分析。最终获得疾病及HYD药效相关基因。第二部分网络药理学数据分析1 HYD相关作用靶标的整理首先从台湾中医药资料库,收集HYD中各味中药所含化学成分的二级结构信息。基于前期建立的中药靶标预测系统和所含化学成分的结构相似性原理,预测HYD中各味中药所含化学成分的候选靶标。将芯片检测得到的HYD药效相关基因与预测得到的该方候选靶标合并,作为本研究HYD相关作用靶标。2 HYD中各味中药所含化学成分的含量测定采用液质联用的方法对HYD中各味中药所含(与抗甲状腺肿大药效相关和网络药理学预测所得关键靶标对应)的化学成分进行含量测定。3已知治疗甲状腺肿大的靶标收集和整理从Drug Bank和KEGG数据库中收集已知治疗甲状腺肿大靶标。4挖掘HYD治疗大鼠缺碘型甲状腺肿大的关键网络靶标基于前期全基因组表达谱芯片检测,获得疾病相关的hub基因和HYD药效相关的差异表达基因,通过网络药理学数据分析得到HYD预测靶标和已知治疗甲状腺肿大靶标,并构建其相互作用网络。5网络拓扑特征值的计算计算每个基因节点的网络拓扑特征值,包括节点连接度、紧密度、介度和边介度值;筛选网络中连接度大于连接度中位数两倍的节点作为网络中的高连接度基因(hubs),并构建上述hubs直接相互作用网络;通过计算上述hubs网络拓扑特征值,并提取上述四种拓扑特征值均大于相应中位数的节点作为重要hubs;对上述重要hubs进行生物学通路的富集分析,发现其中参与甲状腺激素的合成通路的基因,即为HYD治疗大鼠缺碘型甲状腺肿大的关键靶标。此外,按照同样方法获得海藻-甘草药对缓解大鼠缺碘型甲状腺肿大的关键靶标。针对上述结果设计实验进行验证。第三部分实验验证1动物分组SPF级Wistar大鼠32只,雌雄各半,体重量160-180 g。按照随机均衡的原则,将其随机分为空白组、模型组、HYD组和去海藻甘草(Non-HZ/GC)组,每组8只,适应性饲养2天。2造模、给药及取材造模、给药、血清检测及取材方法均参照前期动物实验。最终取得甲状腺组织,一部分甲状腺组织迅速放入4%的多聚基甲醛中固定,进行常规脱水、包埋、切片、HE染色观察甲状腺组织的形态变化;另一部分甲状腺组织置于冻存管中,液氮冻存。采用real-time PCR和western-blotting实验方法验证HYD对其候选靶标基因,包括两种腺苷酸环化酶(Adcy1和Adcy2)、CAMP反应元件结合蛋白1(Creb1)、热休克蛋白5(Hspa5)、人蛋白二硫异构酶A4(Pdia4)、磷脂酶C、β1(Plcb1)、蛋白激酶的两种亚型(Prkca和Prkcb)和甲状腺过氧化物酶(Tpo)的调控作用。此外,采用相同方法验证海藻-甘草反药组合对HYD候选靶标基因,包括Adcy2、ATP酶的一种亚型(Atp1a2)、谷胱甘肽还原酶(Gsr)、碘化酪氨酸脱碘酶(Iyd)、Pdia4、Plcb1和甲状腺球蛋白(Tg)的调控作用。结果:第一部分疾病及HYD药效相关基因的筛选1动物模型的评价及HYD对缺碘型甲状腺肿大大鼠药效学评价造模结束后数据统计显示,与空白组相比,其它各组大鼠血清中T3、T4含量均显著降低(P<0.05,P<0.01),TSH含量均显著升高(P<0.01或P<0.001),提示造模成功。HYD干预后,与模型组相比,大鼠血清中T3、T4含量均显著升高(P<0.05,P<0.01),TSH含量、甲状腺湿重及相对重量均显著降低(P<0.01,P<0.05),然而,去海藻及去甘草组药效并不显著。提示HYD治疗大鼠缺碘型甲状腺肿大疗效显著,推测,海藻-甘草反药组合在此过程中发挥着重要作用。2疾病相关hub基因及HYD药效相关差异表达基因的筛选通过全基因组表达谱芯片检测,获得139个疾病相关hub基因和426个可能与HYD药效相关的差异表达基因。第二部分HYD缓解缺碘型甲状腺肿大关键网络靶标的挖掘1 HYD相关作用靶标的整理基于台湾中医药资料库,共收集565个HYD中各味中药所含化学成分的二级结构信息。基于前期建立的中药靶标预测系统和所含化学成分的结构相似性原理预测得到该方142个候选靶标。将芯片检测得到的HYD药效相关的基因与上述候选靶标合并,作为本研究中HYD相关作用靶标,共632个靶标。2 HYD中各味中药所含化学成分的含量测定采用液质联用技术,对HYD中所含中药的22种化学成分进行含量测定。3已知治疗甲状腺肿大的靶标收集和整理从KEGG和Drug Bank数据库中共收集到10个已知治疗甲状腺肿大的靶标。4挖掘HYD治疗大鼠缺碘型甲状腺肿大的关键网络靶标构建疾病相关hub基因、HYD相关作用靶标以及已知治疗甲状腺肿大靶标相互作用网络,并对网络中的节点进行网络拓扑特征值的计算,共得到77个重要hubs。对上述77个重要hubs进行生物学通路的富集分析,结果发现其中有9个基因均参与甲状腺激素的合成通路,并在其中发挥着重要作用;通过相同方法发现,海藻-甘草反药组合中有8个基因参与甲状腺激素的合成通路。提示,HYD缓解缺碘型甲状腺肿的作用机制可能是通过调节上述9个候选靶标,进而调控甲状腺激素合成通路;海藻-甘草反药组合则可能通过调控上述8个候选靶标组成的信号轴,进而调节甲状腺激素的合成过程。第三部分HYD缓解大鼠缺碘型甲状腺肿大潜在作用机制的实验验证1 HYD能缓解缺碘型甲状腺肿大大鼠甲状腺肿大的严重程度1.1 HYD对缺碘型甲状腺肿大大鼠甲状腺激素水平的影响与模型组相比,给予HYD治疗后,大鼠血清中T3、T4含量均显著升高(P<0.05),TSH含量显著降低(P<0.01)。提示,HYD具有显著治疗大鼠缺碘型甲状腺肿大的作用。1.2 HYD对缺碘型甲状腺肿大大鼠甲状腺湿重和相对重量的影响与空白组相比,模型组大鼠甲状腺湿重及相对重量均显著升高(P<0.001);与模型组相比,HYD干预治疗后,大鼠甲状腺湿重及相对重量均显著降低(P<0.05,P<0.01);与全方组相比较,拆方组大鼠甲状腺相对重量显著升高(P<0.05)。提示,HYD具有显著治疗大鼠缺碘型甲状腺肿大的作用,海藻-甘草药对在此过程中发挥着重要作用。1.3 HYD对缺碘型甲状腺肿大大鼠甲状腺组织病理学的影响HE染色结果显示,与空白组相比,甲状腺肿大模型组大鼠甲状腺组织大部分滤泡腔消失,滤泡上皮细胞明显增高变形,滤泡周围血管丰富。HYD干预治疗后,这种情况可以得到明显改善。2 HYD对其候选靶标基因的调控作用与空白组比,模型组大鼠甲状腺组织中,除Hspa5和Pdia4两个因子外,其它因子m RNA和蛋白的表达水平均显著降低;与模型组比,全方给药后,除Hspa5和Pdia4外,其它因子m RNA和蛋白的表达水平均显著升高。3海藻-甘草反药组合对HYD候选靶标的调控作用与空白组比,模型组大鼠甲状腺组织中,除Pdia4因子外,其它因子m RNA和蛋白的表达水平均显著降低;与模型组比,全方组大鼠甲状腺组织中,除Pdia4外,其它因子m RNA和蛋白的表达水平均显著升高;与全方组比,拆方组大鼠甲状腺组织中Adcy2,Atp1a2和Tpo的m RNA和蛋白的表达水平均显著降低。结论:本研究通过表达谱基因芯片的检测结合药物靶标预测、生物分子网络分析和实验验证,阐释HYD治疗大鼠缺碘型甲状腺肿大的作用机制。实验结果表明,HYD具有改善大鼠缺碘型甲状腺肿病情的作用,其作用可能与调节Adcy1、Adcy2和Tpo等候选靶标,进而调控甲状腺激素合成通路有关。此外,本研究还发现,海藻-甘草反药组合在HYD缓解大鼠缺碘型甲状腺肿大的过程中发挥着重要作用。此项研究为中药复方、中药药物组合等多组分药物作用机制的研究提供方法学参考,有助于促进药物开发和临床应用。