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研究背景支气管哮喘是Th2介导的以气道高反应、可逆的气流受阻、气道嗜酸粒细胞淋巴细胞等浸润、气道黏液高分泌及血清高IgE为特征的气道慢性炎症性疾病。虽然现在哮喘的治疗手段在大多数病人中是有效和可以耐受的,但这些治疗措施都不能改变哮喘潜在的免疫机制,迫切需要新的治疗手段能够在根本上调整哮喘的免疫病理机制,从而产生对免疫应答长期的保护作用。流行病学和临床的资料均提示感染的减少和变态反应性疾病发病率的升高有显著的相关性。Shirakawa等在一项流行病学调查中发现,结核分支杆菌引起的迟发型超敏反应与特异性体质呈显著的负相关。许多动物实验也证明接种分枝杆菌可以预防和缓解过敏性疾病和哮喘的炎症反应和临床表现。然而,分枝杆菌抑制炎症反应的机理尚不完全明了。分枝杆菌通过诱导Th1型细胞因子,并逆转Th1/Th2的失衡状态的机制被广泛接受。然而,Zuany-Amorim研究显示牛分枝杆菌通过非依赖IFN-γ的机制抑制了哮喘鼠气道变态反应炎症。我们实验室的研究也表明早期接种卡介苗(BCG)能够预防晚年激发哮喘小鼠模型气道炎症,但对其低下的IFN-γ没有诱导作用。因此,可能有一个更强有力的机制与Th1、Th2共同参与了哮喘的免疫失衡以及分枝杆菌的作用机制。调节性T细胞(T regulatory cell,Treg细胞)被认为一种重要免疫耐受机制,能够抑制获得性免疫反应。CD4~+CD25~+Treg细胞是最为重要的一种调节性T细胞,其表面持续表达CD25,能够抑制效应性CD4~+和CD8~+细胞的功能。Foxp3(forkhead box p3)是调控CD4~+CD25~+Treg细胞发育及启动抑制功能的总开关基因,特异性表达于CD4~+CD25~+Treg细胞表面。CD4~+CD25~+Treg细胞发挥抑制作用的机制尚不完全清楚,细胞毒淋巴细胞相关抗原4(cytotoxiclymphocyte associated antigen-4,CTLA-4)介导的细胞接触机制被认为是必需的机制,而抑制性细胞因子白介素-10(IL-10)和转化生长因子-β(TGF-β)的作用尚存在争议。越来越多的证据表明,过敏性疾病和哮喘中存在CD4~+CD25~+Treg细胞的功能缺陷或数目异常,而CD4~+CD25~+Treg细胞能够抑制这些疾病的变态反应炎症的发展。利用Treg的免疫抑制功能来预防和治疗过敏性疾病和哮喘是新的可行的治疗思路。Treg被认为参与了BCG防治哮喘炎症反应的机制。分枝杆菌的接种涉及的体内慢性的细胞内感染过程使机体维持一个持续的免疫应答过程,机体免疫系统调动免疫防御机制来控制感染的同时也会以诱导Treg等免疫耐受机制来限制过强的免疫反应。研究显示,结核感染病人以及BCG的接种均可诱导FOXP3的表达以及CD4~+CD2 5~+Treg细胞的产生。鉴于Treg细胞在哮喘发病机制的作用以及分支杆菌感染可能诱导Treg细胞的产生,我们设计本实验以研究BCG接种对哮喘小鼠肺部过敏性炎症的保护作用,是否伴随着CD4~+CD25~+Treg细胞的变化,以及Treg细胞发挥抑制作用的机制,并利用真核表达载体对CD4~+CD25~+Treg细胞关键基因Foxp3进行表达与功能研究。第一部分早期多次接种卡介苗对哮喘小鼠气道炎症及CD4~+CD25~+调节性T细胞通路的影响目的:探讨早期多次接种BCG对哮喘小鼠气道炎症的抑制作用是否伴随着CD4~+CD25~+调节性T细胞的变化及其可能的作用机制。方法:新生的C57BL/6小鼠随机分为3组:哮喘组,BCG(接种)组和对照组。BCG组在出生后第0、7、14天分别接种BCG,而OVA和对照组以等量的生理盐水注射;从第6周起,按照程序予OVA和BCG组卵白蛋白(OVA)致敏并激发,对照组予生理盐水处理。小鼠处死后,检测支气管肺泡灌洗液(BALF)及肺组织中嗜酸粒细胞浸润的情况;使用流式细胞术检测小鼠脾淋巴细胞中CD4~+CD25~+Treg细胞/CD4~+细胞比例;RT-PCR和Western Blot分别检测Foxp3 mRNA和蛋白的表达;脾脏中CTLA-4和GITR的表达也以RT-PCR检测;ELISA检测脾淋巴细胞上清中IL-4、IFN-γ、IL-10和TGF-β的水平。结果:BCG接种显著减轻了哮喘小鼠BALF和肺组织中嗜酸粒细胞的浸润。哮喘小鼠脾淋巴细胞中CD4~+CD25~+ Treg细胞/CD4~+细胞比例低于对照组,BCG接种显著提高了此细胞比例。哮喘小鼠脾脏Foxp3 mRNA和蛋白的表达均高于对照组,BCG接种明显提高了Foxp3的表达。CTLA-4和GITR的表达也在BCG接种组有明显的升高。与对照组相比,哮喘小鼠脾淋巴细胞上清中存在高IL-4,低IFN-γ的失衡状态,BCG接种纠正了这种失衡的极化状态。BCG接种还明显提高了脾淋巴细胞上清中IL-10和TGF-β的水平。结论:新生期多次接种BCG能有效减轻哮喘小鼠气道的变态反应炎症;哮喘小鼠存在CD4~+CD25~+Treg细胞相对数量和功能不足,Treg、Th1和Th2三极之间的失衡参与了哮喘的发病机制;接种BCG能纠正了Th1、Th2的失衡,促进CD4~+CD25~+Treg细胞的活化和关键的转录因子Foxp3表达的增加而产生免疫耐受机制,抑制了炎症反应;CTLA-4、GITR介导的细胞—细胞接触抑制和抑制性细胞因子IL-10和TGF-β可能参与了BCG引起的CD4~+CD25~+Treg细胞抑制作用的机制。第二部分CD4~+CD25~+调节性T细胞转录因子Foxp3转染对哮喘小鼠脾淋巴细胞功能的影响目的:转染Foxp3至哮喘小鼠脾淋巴细胞,探讨Foxp3表达对脾淋巴细胞功能的影响。方法:OVA致敏激发制作哮喘小鼠模型,收集培养脾脏淋巴细胞;使用电穿孔法转染真核表达载体pcDNA3.1(-)-Foxp3至脾脏淋巴细胞,并设转染空质粒组和对照组;RT-PCR和Western Blot检测Foxp3的表达;流式细胞术检测转染后CD4~+CD25~+Treg细胞/CD4~+细胞比例;MTT法检测转染后的脾脏淋巴细胞增殖反应,ELISA检测脾淋巴细胞上清中IL-4、IFN-γ的含量。结果:转染组Foxp3 mRNA和蛋白的表达水平显著高于空质粒组和对照组;转染Foxp3后CD4~+CD25~+Treg细胞/CD4~+细胞比例显著高于空质粒组和对照组;与空质粒组和对照组相比,转染pcDNA3.1(-)-Foxp3质粒明显抑制了脾淋巴细胞增殖;转染组细胞上清中IL-4、IFN-γ含量低于空质粒和对照组。结论:转染pcDNA3.1(-)-Foxp3至哮喘小鼠脾淋巴细胞,Foxp3得到有效表达。Foxp3的高表达能增加CD4~+CD25~+T细胞的数量,抑制哮喘小鼠脾淋巴细胞的增殖和Th1和Th2细胞因子。总结1.新生期多次接种BCG能有效减轻哮喘小鼠气道的变态反应炎症;2.哮喘小鼠存在CD4~+CD25~+Treg细胞相对数量和功能不足,Treg、Th1和Th2三极之间的失衡参与了哮喘的发病机制;3.接种BCG能纠正了Th1、Th2极化状态的失衡,促进CD4~+CD25~+Treg细胞的活化和关键的转录因子Foxp3表达的增加而产生免疫耐受机制,抑制炎症反应;4.CTLA-4、GITR介导的细胞—细胞接触抑制和抑制性细胞因子IL-10和TGF-β可能参与了BCG引起的CD4~+CD25~+Treg细胞抑制作用的机制;5.转染pcDNA3.1(-)-Foxp3至哮喘小鼠脾淋巴细胞,Foxp3得到有效表达。Foxp3的高表达能增加CD4~+CD25~+T细胞的数量,抑制哮喘小鼠脾淋巴细胞的增殖和Th1和Th2细胞因子。诱导Foxp3的表达可能为哮喘的治疗提供新的思路。