论文部分内容阅读
第一部分:肌肉衰减综合征小鼠腓肠肌Sirt1和mTOR活性的变化研究目的观察肌肉衰减综合征小鼠腓肠肌Sirt1和mTOR活性的变化。研究方法将雄性C57BL/6J老年(26月龄)和壮年(6月龄)小鼠各16只分别随机分为2组,每组8只(n=8):即壮年对照(young control,YC)组、壮年后肢悬提(young suspension,YS)组、老年对照(aged control,AC)组及老年后肢悬提(aged suspension,AS)组。YS组和AS组小鼠后肢悬提(hindlimb suspension,HLS)2周,AS组小鼠HLS建立肌肉衰减综合征小鼠模型,利用试剂盒和Western blot等检测小鼠腓肠肌Sirtl活性(即NAD+/NADH比率、NAMPT蛋白表达、Sirt1去乙酰化酶活性、Sirt1及其下游靶蛋白PGC-1α、FOXO1和P53蛋白表达水平)和mTOR信号转导通路(即mTOR、p-mTOR、p70S6K、p-p70S6K、4E-BP1和p-4E-BP1蛋白表达水平)变化。研究结果1、NAD+含量和NAD+/NADH比率:AC组明显低于YC组(P<0.01,P<0.05),HLS组显著少于对照组(P<0.01,P<0.05)。2、Sirt1表达:AC组明显高于YC组(P<0.05),HLS组显著高于对照组(P<0.05)。3、Sirt1下游底物表达(PGC-1α、FOXO1和P53)、与衰老相关的NAMPT蛋白表达和Sirt1活性:AC组明显低于YC组(P<0.05,P<0.05,P<0.01),HLS组显著少于对照组(均P<0.05)。4、磷酸化的mTOR、p70S6K和4E-BP1:AC组明显高于YC组(均P<0.05),HLS组显著少于对照组(均P<0.05)。研究结论Sirt1和mTOR参与了肌肉衰减综合征小鼠的发病。第二部分:Sirt1过表达对肌肉衰减综合征小鼠腓肠肌重量和容积的影响及其机制初步探讨研究目的本部分旨在研究Sirt1过表达对后肢悬提诱导的老年(26月龄)雄性C57BL/6J肌肉衰减综合征小鼠腓肠肌重量及容积的影响,并初步探讨其可能的机制。研究方法预先准备老年(26月龄)和壮年(6月龄)C57BL/6J雄性小鼠32只(老年和壮年小鼠各16只),利用电穿孔技术在小鼠左侧腓肠肌转染pAAV-tMCK-Flag-Sirt1质粒,同时右侧腓肠肌转染pAAV-tMCK-sPolyA质粒作为对照。转染1周后,分别将壮年和老年小鼠再随机分成两组(每组8只,n=8),一组进行HLS实验,另一组正常喂养作为对照。即有YC组、YS组、AC组及AS组。2周以后,分离小鼠两侧腓肠肌,比较各组小鼠腓肠肌组织湿重及肌细胞横截面积(cross-sectional area,CSA)变化。可能的机制探讨:通过脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL)检测腓肠肌细胞核的凋亡状况,利用Western blot检测小鼠腓肠肌mTOR信号转导通路(即mTOR、p-mTOR、p70S6K、p-p70S6K、4E-BP1和p-4E-BP1蛋白表达水平)变化情况。另外,利用试剂盒和Western blot等检测小鼠腓肠肌Sirt1活性(即NAD+/NADH比率、NAMPT蛋白表达、Sirt1下游靶蛋白PGC-1α蛋白表达水平)。研究结果1、在老年组及YS组,pAAV-tMCK-Flag-Sirt1质粒转染的腓肠肌较pAAV-tMCK-sPolyA质粒转染的腓肠肌湿重明显减轻(均P<0.05),同时其肌纤维CSA也明显减少(均P<0.05)。2、在壮年组及老年组,Sirt1过表达均可显著增加肌纤维细胞核的凋亡(均P<0.05)。3、NAD+/NADH 比率、NAMPT蛋白表达和PGC-1α蛋白的表达无论在AC组还是YC组,pAAV-tMCK-Flag-Sirt1 质粒转染的腓肠肌均较pAAV-tMCK-sPolyA质粒转染的腓肠肌组织明显降低(均P<0.05)。4、p-mTOR、p-p70S6K及p-4E-BP1蛋白表达水平无论在AC组还是YC组,pAAV-tMCK-Flag-Sirt1质粒转染的腓肠肌均较pAAV-tMCK-sPolyA质粒转染的腓肠肌组织明显降低(均P<0.05)。研究结论1、肌肉特异性Sirt1质粒在体过表达可加重后肢悬提诱导的肌肉衰减综合征老年小鼠。2、Sirt1过表达加重肌肉衰减综合征老年小鼠的机制可能与其增加细胞凋亡有关。3、肌肉特异性Sirt1质粒在体过表达可降低老年小鼠腓肠肌Sirt1活性。4、Sirt1过表达可降低老年小鼠腓肠肌mTOR信号转导通路活性。