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由于人类活动的影响,环境中锰污染日益严重。生物修复是一种成本低、便于操作且环境友好的新兴修复技术。植物内生细菌可以利用多种方式影响植物对锰的耐性和富集能力,因此,在植物-微生物联合修复锰污染过程中植物内生细菌发挥了极其重要的作用。通过从锰超富集植物美洲商陆中分离和筛选具有促生作用的植物内生菌,不仅可以揭示微生物多样性,丰富微生物资源库,还可以揭示微生物群落结构与植物富集锰的关系,为植物内生细菌强化植物修复锰污染提供理论依据和技术基础。 本文利用可培养方法研究不同的锰浓度处理(0,1,10 mmol L-1)对水培美洲商陆的根茎叶部内生细菌总数、抗性细菌数的影响,结果显示抗性细菌数随Mn浓度升高呈递增趋势。从美洲商陆中共分离内生细菌300株,测定其植物促生特性,研究表明高产IAA(>20μg ml-1)菌株比例同样随Mn处理浓度的升高而呈递增趋势。对分离菌株进行了系统发育分析,研究表明美洲商陆可培养内生细菌主要包括:Firmicutes、Actinobacteria、α-Proteobacteria、β-Proteobacteria和γ-Proteobacteria5个发育类群,此外,不同Mn浓度处理对内生细菌群落结构有显著影响,其中1mmol L-1处理下分离的菌株种类最为丰富,且不同组织间差异也很大,其中茎部分离的菌株种类最为丰富。提取细菌总DNA,采用PCR-DGGE技术研究不同浓度Mn处理对未培养植物内生细菌群落结构的影响,结果表明美洲商陆未培养细菌主要包括:α-Proteobacteria、β-Proteobacteria、γ-Proteobacteria、δ-Proteobacteria、 Cyanobacteria/Chloroplast和Unclassified6个发育类群,其中茎部的种群最为丰富。 根据分离菌株的生物学特性,本实验挑选分离自美洲商陆叶部的Bacillusmegaterium1Y31作为供试菌株,并以杂交狼尾草作为供试植物,进行Mn0和Mn1000 mg kg-1处理土培实验。结果表明,接菌处理与接灭活菌对照相比,供试植物生物量提高2.9%-70.2%,杂交狼尾草吸收的Mn提高8.9%-63.9%。同时接菌处理还提高了杂交狼尾草内生、根际土壤和非根际土壤细菌的总数和抗性细菌数。同时,接菌处理还提高了杂交狼尾草内生、根际土壤和非根际土壤菌株中具有植物促生特性的菌株的比例。另外DGGE结果表明,供试菌株能够成功定殖在杂交狼尾草根际土壤中,接菌处理杂交狼尾草根际土壤细菌种群主要包括Acidobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes等9个发育类群,而非根际土壤细菌种群包括Actinobacteria、Acidobacteria、Chloroflexi等10个发育类群。接菌对不同处理下的植物根际和非根际土壤细菌群落结构无显著影响。 以杂交狼尾草为供试植物在Mn0,2,10 mmol L-1处理下进行水培实验。结果表明,在10 mmol L-1处理下植物Mn含量达到了10000 mg kg-1以上,达到了Mn超富集植物的临界值,且接菌(Bacillus megaterium1Y31)处理可以使杂交狼尾草生物量提高20.6%-93.9%, Mn吸收总量提高22.8%-112%。同时接菌处理还提高了各Mn处理下根部和叶部内生细菌的总数和抗性细菌数量及具有促生功能细菌的比例,且根部大于地上部。PCR-DGGE结果表明供试植物根部内生细菌主要包括Bacteroidetes、Alphaproteobacteria、 Betaproteobacteria、 Gammaproteobacteria、 Firmicutes和Cyanobacteria/Chloroplast6个发育类群,且接菌处理对根内生细菌群落结构有显著影响,叶部内生细菌主要包括Bacteroidetes、Gammaproteobacteria、Firmicutes和Cyanobacteria/Chloroplast4个发育类群,且接菌处理对叶部细菌群落结构无显著影响。 利用2-DE和MS技术研究接菌(Bacillus megaterium1Y31)处理对不同锰浓度处理下水培杂交狼尾草叶部蛋白差异表达的影响。对照相比,接菌处理杂交狼尾草叶部共鉴定出差异蛋白109个,其中发生上调和下调的蛋白分别是66个和43个。这些差异蛋白涉及关于光合作用、能量代谢、环境刺激、活性氧代谢、新陈代谢、信号传递、细胞结构维持、蛋白翻译、加工和降解和未归类共9大类型的蛋白。在非胁迫下(Mn0 mmol L-1),差异蛋白只涉及光合作用、能量代谢、环境刺激、蛋白翻译、加工和降解和未归类5大类别;接菌处理使叶绿体ab结合蛋白、RuBisCO等涉及集光和碳固定的蛋白发生上调,说明菌株1Y31可以提高植物光合作用效率,接菌还促使ATP合酶亚基蛋白、1,7-二磷酸-景天庚酮糖和转酮醇酶等涉及直接生成ATP的关键酶同样发生上调,说明菌株1Y31可以在非胁迫下提高杂交狼尾草光合作用和能量合成效率。在锰胁迫下(Mn2和Mn10 mmol L-1),差异蛋白则涉及关于光合作用、能量代谢、环境刺激、活性氧代谢、新陈代谢、信号传递、细胞结构维持、蛋白翻译、加工和降解和未归类共9大类别,说明锰胁迫对杂交狼尾草叶片蛋白的差异表达有显著影响;接菌处理使叶绿体ab结合蛋白、RuBisCO、放氧增强蛋白和RuBisCO活化酶等涉及到集光、固碳、光合放氧和活化RuBisCO等功能的蛋白发生上调,接菌还促使ATP合酶亚基、柠檬酸缩合酶、磷酸双激酶、磷酸烯醇式丙酮酸羟化酶等直接或通过三羧酸循环间接产生ATP的蛋白发生上调,5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸高半胱氨酸甲基转移酶、谷胱甘肽S基转移酶等涉及到植物抗逆的蛋白发生下调,表明菌株1Y31在锰胁迫条件下可以提高杂交狼尾草光合作用和ATP合成效率,同时还可以提高杂交狼尾草对锰胁迫的耐受,提高其生物量和锰富集总量,达到提高杂交狼尾草锰修复效率的效果。