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醉鱼草Buddleia lindleyana.为马钱科,落叶灌木,主要生长于华东、中南、西南,耐旱,含有黄酮、苯丙素酚苷、萜类、木脂素、皂苷、甾醇、长链脂肪酸酯、生物碱等成份,既具有祛风除湿、止咳化痰、散瘀等药用价值,又具有杀虫等作用。
植物内生真菌能产生大量新的天然产物,有些内生真菌还可以产生与宿主植物相同或相近的代谢产物,已成为天然产物潜在的重要资源。本研究对醉鱼草内生真菌进行了分离,并进行抑制细菌、真菌以及杀虫活性的筛选,对活性菌株进行了ITS-5.8S rDNA序列分析、培养基条件的优化以及发酵液的系统分离的相关研究。本研究旨在探索从醉鱼草内生真菌发现活性成分的可能性,为研究新的天然产物提供思路。主要研究内容如下:
1.采用75％乙醇、次氯酸钠溶液浸泡和无菌水洗涤、培养、分离的工艺分离内生真菌,对准确分离内生真菌的方法和适宜的培养条件进行了系统的研究。研究表明:应同时设置超净工作台无菌状态检测对照、漂洗液检测对照和组织印迹检测对照等3种对照处理,确保内生真菌分离准确性。高浓度次氯酸钠溶液短时间处理比低浓度次氯酸钠溶液长时间处理更适合植物材料的表面灭菌,有利于内生真菌的分离。醉鱼草体内存在内生真菌且种类繁多、十分丰富,共分离到101株内生真菌。
2.以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为筛选模型,采用滤纸片法对分离菌株抑菌活性进行初筛,以新型隐球菌、白色念珠菌、酿酒酵母、康宁木霉、稻链孢霉、亚麻刺盘孢为筛选模型,采用96孔微量板法对分离菌株抑菌活性进行复筛,在101株内生真菌中筛选出18株对以上指示菌都有抑菌作用的活性菌株,占总分离菌株的17.82％。以卤虫模型对分离菌株杀虫活性进行筛选,在101株内生真菌中筛选出校正死亡率>90％的活性菌株18株,占总分离菌株数的17.82％,9株发酵液对卤虫的校正死亡率为100％,占总菌株的8.9％。
3.通过CTAB法提取LL3026的基因组,并用1％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物,确定其分子量为545 bp；通过序列分析确定LL3026属于刺盘孢属Colletotrichum。
4.对活性菌株LL3026的代谢产物进行系统分离,以卤虫的校正死亡率为指标对各部位进行活性跟踪,最终筛选到抑菌活性部位在石油醚相,杀虫活性部位在乙醚相。经GC-MS分析,石油醚相、乙醚相活性化合物分别为4-丁基-邻苯二甲酸辛酯、6-乙基-3-辛基-邻苯二甲酸丁酯。
5.对活性菌株LL3026发酵液的稳定性进行考察,温度、光照及紫外照射对LL3026发酵液杀虫活性无显著影响。