【摘 要】
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生物钟对于生物体提前“预知”环境,做出改变从而更好的适应环境、提高效率、节约能量等具有重大生理意义。不同物种间的生物钟核心振荡器调控机制非常保守,都是基于正/负调控因子组成的转录和翻译的负反馈调控环路。粗糙脉孢菌是研究生物钟的最佳模式生物之一,在粗糙脉孢菌中,正调控因子WHITE COLLAR complex（WCC）作为转录激活因子激活frequency（frq）基因的转录,当细胞内FREQUE
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生物钟对于生物体提前“预知”环境,做出改变从而更好的适应环境、提高效率、节约能量等具有重大生理意义。不同物种间的生物钟核心振荡器调控机制非常保守,都是基于正/负调控因子组成的转录和翻译的负反馈调控环路。粗糙脉孢菌是研究生物钟的最佳模式生物之一,在粗糙脉孢菌中,正调控因子WHITE COLLAR complex（WCC）作为转录激活因子激活frequency（frq）基因的转录,当细胞内FREQUENCY（FRQ）蛋白积累到一定水平,则与 FRQ interaction RNA helicase（FRH）形成 FFC 复合体（FRQ/FRH complex,FFC）反馈抑制WCC的转录活性从而关闭自身转录。frq基因的周期性激活和抑制对生物钟正常运转是必需的,其抑制过程仍然需要进一步研究。本研究发现缺失螺旋-环-螺旋型转录因子centromere binding factor（CBF-1）导致粗糙脉孢菌生物钟周期变长、振幅变弱和生长变慢,而且此生物钟表型依赖于CBF-1的DNA结合结构域;在互补菌株cbf-1KO,qa-Myc-CBF-1中,不加诱导剂QA时,少量Myc-CBF-1的表达即可将cbf-1缺失突变体的生物钟周期和菌丝生长速度回补至近乎野生型状态;而当QA达到一定浓度,诱导表达大量的Myc-CBF-1不仅不能回补其表型,反而导致表型更为严重,其分生孢子带形成节律丧失,这说明CBF-1的蛋白量非常重要。在野生型背景下过表达CBF-1同样导致粗糙脉孢菌分生孢子带形成节律丧失,进一步确定细胞内维持合适的CBF-1蛋白量对于生物钟正常运转的重要性。Northern blot和Westernblot结果显示,缺失cbf-1提高frqmRNA水平而过表达CBF-1导致FRQ蛋白表达量和frq mRNA水平显著降低,因此,CBF-1是frq基因的转录抑制因子。然而在cbf-1缺失突变体中WCC的转录激活活性却明显降低,在cbf-1KOwc-2KO双突变体中可以检测到持续表达的frqmRNA和FRQ蛋白,进一步实验发现缺失cbf-1导致RCM-1蛋白高磷酸化进而在C-box的募集降低,这些结果说明转录抑制因子CBF-1通过促进转录共抑制因子RCM-1在C-box的募集来实现对不依赖WCC的frq基因的转录调控。体内染色质免疫共沉淀（ChIP）和体外凝胶阻滞（EMSA）实验结果显示CBF-1周期性结合加基因的启动子C-box;当没有FRQ蛋白负反馈时,CBF-1抑制WCC在C-box的募集;遗传和生化结果显示,在生物钟节律紊乱的过表达CBF-1菌株中,CBF-1结合C-box增多,相反WCC在C-box募集降低:相比之下,过表达丧失结合DNA能力的CBF-1菌株无生物钟表型,而且此菌株中WCC蛋白表达量和WCC在C-box的募集水平都与野生型类似。这些结果说明过量CBF-1通过增强在C-box的结合能力减少了 WCC在C-box的募集。以上实验结果表明,转录因子CBF-1抑制frq基因转录的分子机制是:一方面CBF-1抑制不依赖WCC的frq基因的转录;另一方面,过多结合在C-box的CBF-1通过减少WCC在C-box的募集降低frq基因的转录。本研究发现适量的CBF-1通过重塑WCC在C-box区域的募集保证生物钟节律性振荡,为稳定生物钟负反馈系统提供一种新的调控方式。
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