论文部分内容阅读
Ⅰ亚群禽腺病毒(FAVⅠ)主要引起的病症是鸡类的包涵体肝炎(IBH)，是一种急性传染病[1]。最近在我国部分地区出现大批量死亡病例，剖检以心包积液、肝炎为特征性病变，称为鸡心包积液-肝炎综合征（鸡安卡拉病）。安卡拉病的病毒与Ⅰ亚群禽腺病毒4型具有相近的遗传进化关系[2]。近年来，包涵体肝炎和安卡拉病在我国发病一直呈上升趋势，给我国鸡类养殖业造成了严重的经济损失。因此，本研究根据我国现包涵体肝炎和安卡拉病的流行现状，筛选了三株Ⅰ亚群禽腺病毒的流行血清型标准毒株和一株安卡拉病病毒制备四价油乳剂灭活苗，其对以上两种疾病的防治和禽类养殖业的发展有着重要的应用价值。 本研究从鸡场采集疑似感染了安卡拉病的病鸡心脏和肝脏，将样品处理后经卵黄囊途径接种7日龄的鸡胚，收获鸡胚尿囊液传代培养。通过PCR技术鉴定，共分离得到4株病毒，针对其Hexon基因序列进行扩增，与Genbank中已发布的Ⅰ亚群禽腺病毒各血清型Hexon基因序列进行比对。结果表明，4株病毒均与Ⅰ亚群禽腺病毒4型属于同一分支，有非常高的同源性。将4株病毒接种SPF肉鸡，攻毒鸡群的发病情况和解剖情况与自然感染安卡拉病的发病鸡一致。 选取本实验室保存的3株Ⅰ亚群禽腺病毒标准毒株，与安卡拉病毒按1∶1∶1∶2比例制成四价油乳剂灭活苗，并检测疫苗注射后机体抗体水平的变化情况，为预防该两种疾病的发生和流行提供科学依据。选取Ⅰ亚群禽腺病毒(FAV-2，FAV-5，FAV-8)和安卡拉病毒，经SPF鸡胚卵黄囊途径和鸡胚原代肝细胞接种病毒，扩增得到种毒，测试各株种毒的鸡胚半数感染量，组织半数感染量，病毒粒子浓度，最佳灭活浓度和最佳灭活时间。经甲醛完全灭活后，制备四价油乳剂灭活苗。对疫苗的物理性状，无菌检验，免疫安全性，最小免疫剂量，免疫效果及抗体水平的变化进行检验。 结果显示，FAV-2、FAV-5、FAV-8、JS201501鸡胚半数感染量分别10-525/0.2 mL、10-667/0.2 mL、10-648/0.2 mL、10-567/0.2 mL，组织半数感染量分别为10-575/0.1 mL、10-767/0.1mL、10-725/0.1 mL、10-637/0.1 mL，实时荧光定量PCR测得病毒粒子浓度分别为105086copies/μL，106304 copies/μL,105371 copies/μL，104560 copies/μL。建议甲醛灭活终浓度为0.15％，灭活时间为24小时，经试验确定疫苗为油包水剂型，粘度和稳定性等性状均符合要求，无菌检验合格。 接种7日龄的自孵化SPF鸡，注射疫苗后均无不良反应，安全性良好，最小接种剂量为0.4 mL/只。接种疫苗两周后开始检测其抗体水平，结果显示疫苗接种后第4周抗体水平达到峰值，随后抗体水平开始迅速下降。免疫攻毒保护性试验结果显示，本疫苗对各病毒的临床保护率为100％，能够预防相应病毒的感染。