论文部分内容阅读
中度嗜盐菌（Halophilic bacteria）泛指能够在3%-15%的Na Cl存在时表现出最适生长的微生物类群。中度嗜盐菌与一般的非嗜盐性细菌相比较,具有特殊的代谢途径、生理生化结构、以及独特的遗传学特性。喜盐芽孢杆菌（Halobacillus sp.）NEAU-ST10-40是本实验室从安达市分离得到的一株中度嗜盐菌,并已经鉴定该菌株代表喜盐芽孢杆菌属（Halobacillus）的一个新种,并将其命名为安达喜盐芽孢杆菌（Halobacillus andaensis）模式菌株NEAU-ST10-40T。本实验采用大肠杆菌（Escherichia coli）缺陷株KNabc（Δnha A,Δnha B,Δcha A）基因功能互补法和基因文库筛选法,从NEAU-ST10-40T中克隆得到1个能够使大肠杆菌（E.coli）KNabc在0.3MNa Cl的LBK培养基上生长的重组子。此重组子在M13F方向的序列分析显示,该重组子包含的外源基因片段长4442 bp,该片段含有4个开放阅读框（ORF1-4）以及各自的SD序列和推测的启动子序列。其中有3个完整的开放阅读框（ORF2-4）,ORF3和ORF4共用一个终止子序列。不完整的ORF1有推测的启动子序列但无终止子序列。其中,被截短的ORF1（M13R,2-788 bp）长789 bp,ORF1与Halobacillus trueperi中的一个推测的甘氨酸甜菜碱转运蛋白（putative glycine betaine transporter,BCCT superfamily）同源性最高（82%）,其基因被命名为甜菜碱转运体,但该序列不完整。ORF2（1985-2351 bp）长369 bp,ORF2与芽孢杆菌（Bacillaceae）中的一个推测的假定蛋白（hypothetical protein,YugN superfamily）同源性最高（73%）,其基因被命名为yug N。ORF3（2457-3513 bp）长1059 bp,ORF3与Halobacillus kuroshimensis中一个推测的未知功能的UPF0118 family protein,UPF0118superfamily)同源性最高（81.5%）,其基因被命名为upf0118。ORF4（3551-4096 bp,M13R）长548 bp。ORF4与Halobacillussp.BBL2006中一个推测的GNAT家族乙酰转移酶（GNAT family acetyltransferase,NATSF superfamily）同源性最高（63%）,其基因被命名为GNAT家族乙酰转移酶。通过基因亚克隆,我们发现upf0118基因能够与大肠杆菌（E.coli）KNabc发生互补,使其在0.3 M NaCl、30 mM LiCl以及碱性pH 8.0条件下生长并与重组子几乎一致。同时,利用软件对UPF0118的氨基酸残基组成和拓扑学分析显示,此蛋白由352个氨基酸残基组成,具有6个跨膜区,其中有225个残基是疏水性氨基酸,从而说明UPF0118是低极性的。用DNAMAN 6.0预测其分子量为39,611.01Dalton,等电点pI为9.76。这初步判断UPF0118蛋白可能具有Na+/H+逆向转运蛋白活性且为一个膜蛋白。构建系统发育树表明,UPF0118与其家族中的同源物单独成簇,而与所有已知的单基因Na+/H+逆向转运蛋白和具有Na+/H+逆向转运蛋白功能的单基因蛋白距离较远。蛋白同源性比对显示,UPF0118与来自于H.kuroshimensis中同源物的相似性最高为81.5%,其次为来自H.alkaliphilus（accession.version No.SFF94744.1）,H.halophilus（accession.version No.W P014643083.1）,H.dabanensis（accession.version No.WP075036522.1）,H.karajensis（accession.version No.SEH70700.1）,Virgibacillus sp.SK-1（accession.version No.WP053219791.1）,Sediminibacillus albus（accession.version No.SDJ74814.1）,Thalassobacill us cyri（accession.version No.SEB17075.1）,Pontibacillus chungwhensis（accession.version No.WP036781630.1）and P.marinus（accession.version No.WP027448163.1）的同源物,相似性分别为79.3%,78.7%,78.7%,77.8%,69.0%,67.3%,65.1%,63.1%和58.4%。在以上的同源物的序列比对时,我们发现了五个高度保守的花边序列（motif）,分别为"LVYL IALFLFMLE","GFLKAQFLVS","PIIGSI","LLAIRRTVEPKVMGRHIGLSPLATLIAM"和"I AFNSAKEAGII"。为了进一步鉴定UPF0118的蛋白功能,本研究测试了基于大肠杆菌（E.coli）KNabc宿主菌株的反转膜蛋白活性。测试的结果证实了含有upf0118基因的KNabc/p UC-UPF0118在pH为7.5-9.5时,表现出Na+（Li+）/H+逆向转运蛋白活性,且当p H 9.0时活性最高,这说明upf0118基因编码Na+（Li+）/H+逆向转运蛋白对质子梯度动力势具有一定的依赖性。通过对UPF0118制备膜蛋白,利用Western blot对UPF0118进行定位实验,将UPF0118定位到细胞质膜上,从而鉴定UPF0118是一个膜蛋白。进一步说明UPF0118应该代表一种新型的Na+（Li+）/H+逆向转运蛋白。