应用DNA免疫技术制备肝脏特异基因FF456抗体

• 作 者: 何广武
• 机 构: 南京大学
• 出 处: 南京大学
• 发表日期: 2004年期
• 关键词: FF456抗体 DNA免疫 抗血清 免疫荧光染色 肝脏组织

FF456是本实验室克隆的新基因，该基因与嗅觉受体具有高度同源性，属于C类G蛋白偶连受体(Gprotein-coupledreceptor，GPCR)。Northernblotting及RT-PCR结果表明，FF456在肝脏组织中的表达具有高度特异性，且在肝癌组织中的表达下调。为了开展FF456功能的研究，我们制备了FF456的抗体，并利用该抗体检查了FF456蛋白在正常肝脏组织和肝癌组织中的表达和分布情况。主要结果有：
一、DNA免疫方法的建立将含白蛋白、VEGF基因的重组pCMV6-XL4质粒，以不同剂量(100μg和200μg)和注射方式(肌肉注射和皮下注射)免疫6-8周龄雌性BALB/c小鼠，用ELISA测定抗体的相对滴度，用westernblotting检测其特异性。DNA免疫得到的白蛋白和VEGF抗血清最大滴度分别为110000和12000，抗血清特异性良好。实验结果表明，裸质粒DNA直接注射BALB/c小鼠即能得到高滴度的抗体，DNA免疫制备抗体是一种简单、快捷的方法，并且可以高通量制备高亲和力的抗体。
二、DNA免疫制备肝脏特异基因FF456的抗体及其应用1、原核表达FF456特异肽段通过氨基酸序列分析，选取了一段含50个左右氨基酸的FF456特异肽段(FF456-part)，利用原核表达质粒pGEX-2T构建FF456-part的GST融合表达载体，在大肠杆菌中实现了FF456肽段的高效表达。利用该肽段作为抗原，检测DNA免疫得到的FF456抗血清的滴度及特异性。
2、DNA免疫制备FF456抗血清将FF456全长基因克隆于pCDNA3.1(一)真核表达质粒，直接免疫6-8周龄雌性BALB/c小鼠，并对DNA免疫的条件(注射方式、免疫剂量和质粒溶剂)进行优化，最终得到了高滴度的FF456抗血清。WesternBlotting及ELISA结果表明，DNA免疫得到的FF456抗血清特异性良好，最大抗血清滴度为50000左右。
3、利用FF456抗血清进行免疫荧光染色实验利用FF456抗血清对正常肝脏组织和肝癌组织进行免疫荧光染色实验，检查了FF456在正常肝脏和肝癌组织中的分布和表达情况。结果显示FF456在正常肝实质细胞中广泛表达，在肝癌细胞中的表达量明显下调。