【摘 要】
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多粘菌素被认为是治疗多药耐药革兰氏阴性菌感染的“最后一道防线”,然而质粒介导的可水平转移的多粘菌素耐药基因mcr-1的发现严重威胁该药的临床应用。多项研究表明,养殖动物肠道是mcr-1基因发生发展的重要场所和贮藏库,然而目前对该基因在动物肠道菌群中的分布特征和传播扩散模式却知之甚少。本研究以一头猪的肠道菌群为研究对象,开展多粘菌素耐药菌株分离鉴定工作,建立多粘菌素耐药菌株库。利用PCR技术进行mc
【基金项目】
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国家自然科学基金-地区基金项目“猪源喹诺酮类耐药沙门氏菌产生机制与适应性研究”（项目编号:31860714）支持课题主持人:夏利宁教授 （新疆农业大学动物医学学院）； 国家自然科学基金面上项目“STX/R391元件在动物源细菌中的流行、进化及其与细菌毒力的关联性”（项目编号:31672606） 支持 课题主持人:李蓓蓓 副研究员（中国农业科学院上海兽医研究所）
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多粘菌素被认为是治疗多药耐药革兰氏阴性菌感染的“最后一道防线”,然而质粒介导的可水平转移的多粘菌素耐药基因mcr-1的发现严重威胁该药的临床应用。多项研究表明,养殖动物肠道是mcr-1基因发生发展的重要场所和贮藏库,然而目前对该基因在动物肠道菌群中的分布特征和传播扩散模式却知之甚少。本研究以一头猪的肠道菌群为研究对象,开展多粘菌素耐药菌株分离鉴定工作,建立多粘菌素耐药菌株库。利用PCR技术进行mcr-1基因检测,采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱技术（MALDI-TOF MS）对mcr-1阳性菌株进行种属鉴定与亲缘关系分析,分析mcr-1基因在猪肠道菌群中的宿主分布特征与传播规律。在此基础上,利用全基因组测序和生物信息学分析等技术阐明mcr-1的传播扩散分子机制,为理解mcr-1在肠道菌群中的发生发展及其防控提供科学依据。本试验以一头猪的肠道内容物作为研究对象,利用添加抗生素的平板进行筛选,分离鉴定收集多粘菌素耐药菌株,采用MALDI-TOF MS技术来鉴定细菌种属。共计获得410株多粘菌素耐药菌,包括大肠杆菌70株（17.2%）、肺炎克雷伯氏菌19株（4.6%）、奇异变形杆菌46株（11.0%）、产气巴斯德菌82株（20.0%）和未能鉴定细菌193株（47.2%）,经PCR检测,282株为mcr-1阳性菌株,包括70株大肠杆菌、19株肺炎克雷伯氏菌和193株未能鉴定细菌。利用MALDI-TOF MS技术生成的菌体蛋白质指纹图谱对mcr-1阳性菌株进行聚类分析显示,70株mcr-1阳性大肠杆菌呈现细菌分型的多样性,可被划分为13个亚型,19株肺炎克雷伯菌被分为3个亚型,其中有17株细菌属于同一亚型（占89.5%）,193株未能鉴定细菌的蛋白指纹图谱呈现高度一致性,说明这些菌株均为同一种细菌,且为同一克隆。mcr-1阳性菌株分型的多样性和克隆性并存现象提示mcr-1耐药基因在猪肠道菌群中同时存在克隆传播和水平转移。选取上述未能鉴定细菌中的代表菌株GY-402深入研究其mcr-1的基因环境和传播扩散机制。采用Illumina Hiseq2 000和Min ION双平台测序获取GY-402的基因组完成图。利用JSpecies WS online server平台对GY-402进行种属鉴定显示,菌株GY-402是一种新型的放线杆菌属细菌（Actinobacillus sp.）。生物信息学分析显示,mcr-1基因位于一个新型的整合性接合元件（ICEAsp1）上,该元件长度为72 978 bp,mcr-1与其他9个耐药基因共同组成一个多重耐药基因簇。反向PCR证明ICEAsp1元件可形成环化中间体。接合转移试验表明,ICEAsp1具有可转移性,转入大肠杆菌和多杀巴氏杆菌的频率分别约为5.8×10-8和4.3×10-9,对接合子和原始菌株的MIC测定也表明,该元件携带的耐药基因可导致相应抗生素MIC值的上升。进一步对ICEAsp1的多药耐药区结构进行分析表明,1个ISVsa5和4个ISApl1散布在9个耐药基因中,且该区域的4个ISApl1元件之间可两两组合形成携带不同耐药基因的复合转座子。此外,在多药耐药区域还发现一个新的氯霉素耐药基因,命名为cat T。基因克隆和功能验证表明,cat T是一个具有活性的氯霉素耐药基因,属于新型Cat-A亚族A-17。综上所述,本研究初步探索了mcr-1在猪肠道菌群中的分布特征,mcr-1携带菌株的分型多样性和克隆性并存的现象提示该基因在猪肠道菌群中具有水平转移和克隆传播两种方式。携带mcr-1基因的新型ICE元件在新型放线杆菌属细菌中的发现表明,mcr-1基因具有更广泛的种属分布和更多样的传播载体,应进一步开展重要耐药基因在不同动物肠道菌群中的分布特征和传播扩散机制研究。
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