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病毒性出血热(Viral hemorrhagic fevers,VHFs)是一类由RNA病毒引起,并以发热和出血为主要临床表现特征的可危及人类和动物生命健康的急性传染病[1],该病主要由丝状病毒科、黄病毒科、沙粒病毒科和布尼亚病毒科等4种不同科的病毒引起。出血热病死率高,危害严重,并且大部分无可用疫苗和有效的治疗手段,因此,建立出血热病毒快速、简便,尤其是适用于现场的应急检测方法,对于及时筛查可疑患者及早控制病毒的传播流行具有重要意义。扎伊尔型埃博拉病毒(Zaire ebolavirus,ZEBOV)、苏丹型埃博拉病毒(Sudan ebolavirus,SEBOV)、拉沙病毒(Lassa virus,LASV)、马尔堡病毒(Marburg virus,MARV)和黄热病毒(Yellow fever virus,YFV)等均属于出血热相关病毒,具有很高的传染性和致死率,并且都曾在国外引起不同程度的暴发流行,造成了极大的危害。目前在我国未曾发现这些病毒的传播和流行,但是随着我国对外交流日益频繁,这些病毒的输入性风险不断增大[2],为防范于未然,我们有必要对这些病毒进行更加深入的研究,并建立该类病毒快速简便的检测技术,以便及早地发现和鉴别病原体,为有效阻断病毒的传播奠定基础。目前对于出血热病毒的实验室检测方法主要包括病毒分离鉴定、核酸检测[3]、抗原抗体检测等。其中,病毒分离鉴定是疾病诊断的金标准,但通常需要较高的实验室条件和操作技能,而且耗时较长,存在着生物安全风险[4]。核酸检测技术主要通过对病毒靶基因的特异性扩增来进行鉴别诊断,主要包括普通PCR和实时荧光定量PCR技术。普通PCR技术简单易行,耗时短,但敏感性不高。实时荧光定量PCR技术具有快速、灵敏和特异性高的特点[5-8],可以实时观察整个扩增过程,并对初始扩增模板进行定量分析。以PCR为基础的核酸检测方法虽然简单快速,但都需要较为昂贵的仪器设备并在实验室中完成检测。抗原抗体检测目前应用较多的主要是ELISA检测技术,虽然该检测方法已经发展较为成熟,但与核酸检测技术相比,过程仍旧较为繁琐耗时。由此可见,以上病毒实验室检测方法在突发传染病的现场快速检测中存在局限。本研究针对上述5种出血热病毒建立一种基于新型核酸等温扩增技术-重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification,RPA)[9,10]的检测方法。该技术通过模拟体内DNA复制的酶反应过程,可以在恒温37℃-42℃之间对模板DNA进行指数式扩增,无需变性,在20分钟之内即可完成整个扩增过程。RPA技术操作简单,对设备要求低,具有灵敏度高、特异性强等特点。本研究根据上述5种病毒的基因保守区域设计并合成多套相应的RPA引物和探针,进行筛选优化,得到具有灵敏度高、特异性强的RPA引物探针。其次,根据基因保守片段制备含5种出血热病毒目的基因的假病毒作为RPA反应体系的阳性参考品。最后,对RPA反应体系进行优化,并和Real-time PCR检测方法进行灵敏度的比较,对RPA反应体系扩增性能进行了评价。将制备的假病毒作为模拟样本处理,然后提取核酸进行RPA扩增,同时取本室保存的黄热病毒减毒株17D(YF17D)提取病毒核酸,进行RPA扩增,以验证建立的RPA扩增技术的检测效果。扩增结果表明,本次建立的RPA检测技术在37℃-42℃之间对这5种出血热病毒的RNA可以进行有效的扩增,具有良好的特异性。而扩增的灵敏度,黄热病毒和马尔堡病毒RPA扩增与实时荧光PCR相同,达到1.5×102 copies/反应,扎伊尔型埃博拉病毒、苏丹型埃博拉病毒和拉沙病毒RPA扩增灵敏度为1.5×103 copies/反应。在检测YF17D核酸时,其扩增灵敏度与Real-time PCR一致。由此显示,本实验建立的RPA检测技术扩增效果好,可适用于非实验室条件下的现场应急检测应用当中。