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目的构建含抗转铁蛋白受体单链抗体(TfR-scFv)和EGFP融合蛋白基因的重组真核表达载体pTfRscfv-EGFP。并转染至COS-7细胞中进行表达,鉴定融合蛋白的生物学活性。为单链抗体-荧光融合蛋白在肿瘤示踪、定位、显像等方面的研究奠定基础。方法以Chi7579-pγ-Expr和Chi7579-pκ-Expr载体为模板,设计两对引物引入中间连接肽(Gly4Ser)3以及酶切位点HindⅢ和BamHⅠ,采用重叠延伸PCR的方法,分别扩增抗TfR单链抗体的轻、重链可变区(VL、VH)基因,二基因之间以连接肽(Gly4Ser)3的编码序列连接,从而构建具有前导肽的L-VH-Linker-VL单链抗体基因。将获得的单链抗体基因克隆至pGEM-T载体(scFv-T),转化大肠杆菌DH5α,进行蓝白筛选,挑取阳性克隆扩增。提取质粒以HindⅢ和BamHⅠ双酶切鉴定,并测序证实正确后,亚克隆至pEGFP-N1,获得pTfRscfv-EGFP,转染COS-7细胞,倒置相差荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,荧光分光光度计检测细胞分泌上清荧光强度,并通过流式细胞术(FCM)检测细胞分泌上清与乳腺癌细胞MCF-7及黑色素瘤细胞A375的结合活性。结果测序结果表明获得了正确的L-VH-Linker-VL单链抗体基因序列;亚克隆至pEGFP-N1后,HindⅢ和BamHⅠ双酶切可见约800bp的小片段和约4.5Kb的大片段,与理论计算值相符,表明pTfRscfv-EGFP真核表达载体构建成功;表达载体瞬时转染COS-7细胞,24小时后,可见荧光在细胞中呈指环状分布,细胞核无表达,为典型的分泌性表达模式,而pEGFP-N1空载体转染细胞中,荧光则呈弥漫性分布,以核中分布较多。收集转染后72h的细胞培养上清,用F4500荧光分光光度计检测其荧光强度,实验组细胞上清的荧光强度较对照组高出约两倍以上,证实抗TfR-scFv-EGFP融合蛋白在转染细胞中分泌性表达;FCM检测转染细胞培养上清与A375细胞及MCF-7细胞的结合,结果表明抗TfR-scFv-EGFP融合蛋白能够与上述天然高表达TfR的细胞特异性的结合,对照组细胞培养上清则未见与上述细胞有结合。结论成功构建抗TfR-scFv-EGFP融合蛋白的真核表达载体pTfRscfv-EGFP,融合蛋白可在COS-7细胞中分泌性表达,且具有与TfR阳性细胞结合的活性并发绿色荧光,本实验为进一步将该融合蛋白作为肿瘤示踪、定位、显像的特异性分子奠定了基础。