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目的:
以Hek293细胞（人胚肾细胞）和HK-2细胞（人肾小管上皮细胞）为考察对象，从细胞生长和增殖活性、细胞形态学、细胞结构的损伤、细胞凋亡和细胞氧化损伤等方面进行体外肾细胞毒性研究，尝试建立判定药物细胞毒性强弱的分级标准，初步建立细胞水平上的中药肾毒性筛选技术方法。在此基础上，以MDC自噬染色、自噬电镜观察及自噬特异性基因检测，并与肾细胞损伤的相关结果进行对比分析，考察通过检测自噬评价药物肾毒性的可行性和适用性，建立基于自噬的中药肾细胞毒性评价技术方法。
方法:
1.细胞水平中药成分肾毒性筛选:
(1)采用MTT法、细胞功能性指标LDH和光镜下细胞形态学的检测，对部分中药成分及关木通含药血清进行肾细胞毒性检测，并选择两种具有明确肾细胞毒性的成分。
2.目标成分肾细胞毒性的研究:
(2)MTT法检测给药后细胞活力的时—效和量—效关系。
(3)测细胞上清功能性指标LDH的变化。
(4)光镜检测给药后肾细胞的形态学变化。
(5)采用Hochest33342-Pi双标染色和AnnexinV-PI流式检测给药后肾细胞的凋亡和坏死。
(6)给药后测细胞内SOD和MDA的变化。
(7)采用电镜观察给药后肾细胞的亚显微结构变化。
3.细胞自噬的发生及其检测:
(8) MDC染色、电镜观察给药后肾细胞自噬的产生。
(9)自噬特异性基因Beclin-1基因的检测。
(10) MDC染色测部分中药成分及关木通含药血清引起的自噬产生。
结果:
1.细胞水平中药成分肾毒性筛选:
(1)薯蓣皂苷、蝙蝠葛碱、吴茱萸次碱、马兜铃酸A、吴茱萸碱、商陆皂苷元、商陆皂苷甲有较强的肾细胞毒性，吴茱萸内酯、石蒜碱有一定的肾细胞毒性，葛根素、盐酸水苏碱、川楝素、盐酸益母草碱、黄独素B、仙茅苷、辛弗林、马钱子碱和关木通含药血清暂未显示肾细胞毒性。根据MTT结果以及药物毒性作用强度，估算IC50的范围，以此为基础，尝试对中药成分肾细胞毒性进行初步分级，标准如下:++++(0＜IC50≤5),+++(5＜IC50≤50),++(50＜IC50≤200),+(200＜IC50≤1000)，—(IC50＞1000)。
2.目标成分肾细胞毒性的研究:
(2)薯蓣皂苷和商陆皂苷甲能显著降低肾细胞的活力，且存在一定的时—效和量—效关系。
(3)薯蓣皂苷和商陆皂苷甲能升高培养上清中的LDH。
(4)薯蓣皂苷和商陆皂苷甲能使肾细胞形态不同程度出现皱缩、减少、甚至死亡。
(5)薯蓣皂苷和商陆皂苷甲能使肾细胞不同程度发生凋亡和坏死现象。
(6)薯蓣皂苷和商陆皂苷甲能使肾细胞中SOD、MDA分别出现相应的降低和升高。
(7)薯蓣皂苷和商陆皂苷甲能对肾细胞的亚显微结构产生损伤。
3.细胞自噬的发生及其检测:
(8)薯蓣皂苷和商陆皂苷甲能使肾细胞MDC自噬泡染色的绿色荧光强度增加，肾细胞胞浆中产生融和分裂自噬现象。
(9)薯蓣皂苷和商陆皂苷甲能升高肾细胞中的Beclin-1。
(10)马兜铃酸A、蝙蝠葛碱、吴茱萸碱和商陆皂苷元和关木通含药血清均能使肾细胞MDC自噬染色的绿色荧光强度增加，而葛根素、马钱子碱、盐酸益母草碱作用下的肾细胞MDC染色结果为阴性。
结论:
1.以Hek293细胞（人胚肾细胞）和HK-2细胞（人肾小管上皮细胞）为考察对象，通过对细胞活力检测、细胞形态学观察和细胞上清液功能性指标检测，以IC50为指标，尝试建立了判定药物肾细胞毒性强弱的分级标准，为建立肾毒性中药成分的数据库提供了实验资料。
2.从细胞生长和增殖活性、细胞形态学、细胞结构的损伤、细胞凋亡和细胞氧化损伤等方面进行体外肾细胞毒性的研究，初步建立了细胞水平上的中药肾毒性评价技术方法。
3.通过对MDC自噬染色、自噬电镜观察及自噬特异性基因检测，并与肾细胞损伤的相关结果进行对比分析，明确了自噬检测用于中药肾细胞毒性评价的可行性;同时，采用MDC自噬染色对中药肾细胞毒性进行了快速检测，初步建立了基于自噬的细胞水平上中药肾细胞毒性评价技术方法。