论文部分内容阅读
低聚糖具有显著的生理功能，已成为近年糖生物学的研究热点。低聚糖通常是由2～10个单糖通过糖苷链连接形成的直链或支链的一类低度聚合糖，作为其中的一种低聚半乳糖是在乳糖分子的半乳糖基一侧连接上1～4个半乳糖基生成的低聚糖类。目前，世界上低聚半乳糖的工业产品主要是利用生物技术，用β-半乳糖苷酶的水解活性和转糖基活性以乳糖来进行生产。
迄今为止，很多不同微生物来源的β-半乳糖苷酶已被分离并且用于低聚半乳糖的生产．由于酶的来源不同，其水解活性和转糖基活性相对比例、产物中低聚半乳糖的所占比例以及产物结构也有很大不同。
本文通过水解活性和转糖基活性筛选，从实验室97株保存菌种中获得一株具有转糖基活性的β-半乳糖苷酶产生菌，克隆并序列分析了该菌株16S rDNA基因片断，GenBank收录号为DQ267829．综合其形态学特征、生理生化特征及16S rDNA序列同源性分析结果，将其鉴定为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)2-37-4-1．确定了该菌株β-半乳糖苷酶产酶培养基的碳源为乳糖l％，氮源为蛋白胨0.5％和酵母膏0.5％．培养条件为37℃摇床培养18h；碳源实验证明，该菌株β-半乳糖苷酶产生为乳糖诱导型．利用薄层层析技术研究了pH值、乳糖底物浓度、反应温度和反应时间对该菌株β-半乳糖苷酶以乳糖为底物转糖基合成低聚半乳糖的影响，确定最适反应条件为pH7.5、50mmol/L(磷酸缓冲液)配制的30％乳糖溶液，55℃反应24h转糖基反应产物高压液相色谱分析其组成为低聚半乳糖25.68％、双糖(包括乳糖和转移二糖)33.02％、葡萄糖26.37％和半乳糖14.92％。
进一步对巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)2-37-4-1产生的转糖基β-半乳糖苷酶进行了纯化和酶学性质研究．细胞采用超声波破碎得无细胞提取液，然后经过硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow柱层析、Gigapite K-100S柱层析及APTG亲和层析，酶蛋白在SDS-PAGE中银染为一条带，分子量为125.9kD，获得电泳纯的β-半乳糖苷酶，酶的比活力提高了10.2倍，活力回收率为7.1％，纯化后的酶蛋白的Nativegradient PAGE结果显示该酶的活性自然状态是一个分子量为126.5kD的单亚基蛋白．酶的性质研究表明，该酶的最适反应温度为55℃-20℃保存具有较好的低温稳定性：最适反应pH为7.5，酶在pH6.0～9.0之间比较稳定．在55℃以乳糖为底物进行反应的Km=16.2mmol/L，Vmax=54.05μmol/(L.min)；该酶对β-D-半乳糖苷键具有高度的专一性，与糖苷键相连的配基对酶活也有很大影响；该酶转糖基反应具有广泛的糖基受体，可利用多种糖类为受体进行转糖基反应。以上工作为进一步对Bacillus megaterium 2-37-4-1β-半乳糖苷酶的基因克隆、基因突变和基因改造以获得高效转糖基活性的β-半乳糖苷酶奠定了基础。