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蚊能传播多种疾病，严重危害人类健康。蚊唾液腺中存在多种功能蛋白，如抗凝剂、抗炎剂和免疫流行病学分子靶标等。虽然，已有报道蚊唾液腺30KD的蛋白组分是主要的分泌蛋白，具有很强的抗原性，但是其单个成员的蛋白抗原性及是否具有其它生物学活性尚不清楚。最近报道了其成员之一的埃及伊蚊(Aedesaegypti)aegyptin蛋白具有抗凝血活性，能特异性阻断血小板和胶原蛋白的结合。本文通过生物信息学分析发现，白纹伊蚊（aedes albopictus）30KD蛋白家族的一个成员与aegyptin蛋白高度同源，命名为白纹伊蚊唾液腺aegyptin相似蛋白（A.albopictus aegyptin-like protein，alALP），并构建表达载体，制备了重组alALP，初步分析了其抗原性及抗凝血活性。 目的： 构建alALP的原核表达系统和真核表达系统，制备重组alALP融合蛋白，分析其抗原性和抗凝血活性，探讨alALP作为暴露蚊叮咬免疫流行病学分子靶标和抗凝血活性药物的可行性。 方法： 1.生物信息学分析。运用生物信息学方法分析蚊唾液腺30KD蛋白家族的系统发育树，分析alALP与aegyptin蛋白的同源性、二级结构、亲水性和抗原肽段，分析alALP蛋白的信号肽和成熟肽。 2.alALP基因的克隆。提取白纹伊蚊唾液腺总RNA，根据alALP的基因编码序列(Genbank: AAV90693.1)设计引物，RT-PCR扩增alALP的成熟肽基因，亚克隆至pMD19-T载体，测序验证。 3.alALP的原核表达和抗原性分析。扩增alALP的成熟肽基因，克隆到E.ColiBL21原核表达载体(pGEX-6P-1)，经IPTG诱导表达。利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析重组融合蛋白GST-alALP的表达情况。利用谷胱甘肽琼脂糖4B和超滤器纯化浓缩GST-alALP，皮下注射免疫ICR小鼠3次，每次免疫剂量60μg，制备小鼠抗GST-alALP血清。分别以小鼠抗GST-alALP血清和白纹伊蚊叮咬后小鼠血清为一抗，Westernblotting分析GST-alALP的抗原性。 4.alALP的真核表达和抗凝血活性分析。根据毕赤酵母密码子偏好，优化合成alALP的成熟肽基因，克隆到毕赤酵母X33真核表达载体(pPICZαA)中进行表达。利用SDS-PAGE和Western blotting分析重组融合蛋白ralALP的表达情况。ralALP经镍螯合亲和层析柱纯化、透析袋换液和超滤器浓缩，手动法检测其对凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(APTT)的影响，以分析alALP的抗凝血活性。 结果： 本文构建了蚊唾液腺30KD蛋白家族的系统发育树;比对分析了alALP与aegyptin等蛋白的同源性;成功构建了alALP的原核和真核表达系统;初步分析了alALP的抗原性和抗凝血活性，得出了如下主要结果和结论: (1)蚊唾液腺30KD蛋白家族在进化上保守，而alALP较AAPP和GE rich蛋白与aegyptin更接近;alALP与aegyptin的蛋白序列具有65.58％的一致性，它们的羧基端十分保守，它们具有相同的信号肽、相似的亲水性和一段保守的抗原肽段;alALP、aegyptin、AAPP和GE_rich蛋白的羧基端保守，它们的二级结构具有相同的折叠域。这些结果预示，alALP可能具有aegyptin相似的生物学活性。 (2)成功扩增到目的alALP基因并将其克隆到了pMD19-T载体中，经测序证实该DNA片段就是目的alALP基因。 (3)成功构建了高表达的alALP原核表达系统。在37℃、1mmol/LIPTG诱导6～8 h，重组融合蛋白GST-alALP表达量高且无降解，主要以可溶性蛋白形式表达。GST-alALP具有很强的抗原性，免疫小鼠能诱导产生特异性抗体，且能被白纹伊蚊叮咬后的小鼠血清识别。这些结果说明，alALP具有进一步作为暴露蚊叮咬的免疫流行病学分子标志物的研究意义。 (4)成功构建了高表达的alALP真核表达系统。在30℃、1％甲醇诱导48 h，重组蛋白ralALP表达量高且无降解，可以被正常分泌到细胞外。ralALP具有抗凝血活性，能显著延长凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(APTT)。alALP的抗凝血机制是否和aegyptin一样特异性阻断血小板和胶原蛋白的结合，还无法确定。这些结果表明，alALP具有进一步开发为抗凝血活性药物的可能性。 结论： 本文对alALP的生物信息学分析和重组表达结果表明，该蛋白具有进一步作为暴露蚊叮咬的免疫流行病学分子标志物和开发为抗凝血活性药物的可能性。本文为进一步研究alALP的生物学活性奠定了基础，同时为研究蚊唾液腺功能蛋白提供了一种新的思路。