【摘 要】
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背景与目的:非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的发生发展与遗传易感性及内质网应激等密切相关。国际最新基于流行病学与遗传学的研究发现内质网跨膜蛋白TM6SF2是一个重要的NAFLD致病风险因子,其E167K多态性与NAFLD进程显著相关。TM6SF2在肠道组织高表达,在细胞内跨内质网定位,但TM6SF2在肠道中的生理功能及其对脂质代谢和NAFLD的发生发展的作用与机制尚不明确。本研究拟构建TM6SF2
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背景与目的:非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的发生发展与遗传易感性及内质网应激等密切相关。国际最新基于流行病学与遗传学的研究发现内质网跨膜蛋白TM6SF2是一个重要的NAFLD致病风险因子,其E167K多态性与NAFLD进程显著相关。TM6SF2在肠道组织高表达,在细胞内跨内质网定位,但TM6SF2在肠道中的生理功能及其对脂质代谢和NAFLD的发生发展的作用与机制尚不明确。本研究拟构建TM6SF2肠道特异性敲除（knockout）的小鼠模型,在动物水平研究肠道TM6SF2蛋白对小鼠肝脏脂质代谢和NAFLD发生发展的作用。方法:基于CRISPR/Cas9技术构建TM6SF2肠道特异性敲除小鼠模型（TM6SF2GKO）。利用q RT-PCR及Western-Blot检测TM6SF2 GKO小鼠的小肠及其他组织器官中TM6SF2 mRNA和蛋白的表达情况,确认肠道特异性敲除效果。利用普通饮食和高脂饮食饲养（NAFLD造模）野生型（WT）小鼠和TM6SF2 GKO小鼠12周,对上述小鼠模型及正常对照小鼠进行糖代谢和脂质代谢相关指标的检测。记录小鼠在生长过程中的体重变化,并记录小鼠口服葡萄糖耐量试验（OGTT）情况。用ELISA试剂盒检测上述小鼠模型及正常对照小鼠肝脏内甘油三脂（TG）的含量,以及血浆中TG、高密度脂蛋白（HDL）、天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）等生化指标及胰岛素抵抗（IR）的差异。利用油红染色及HE染色观察上述小鼠模型及正常对照小鼠肝脏组织及小肠组织脂质含量及病理学变化。利用上述TM6SF2 GKO小鼠和WT小鼠的小肠上皮细胞,定性检测小肠上皮细胞中脂质积累量,探究肠道TM6SF2蛋白对肠道脂质吸收转运以及对小鼠肝脏脂肪代谢和NAFLD发生发展的作用。结果:我们成功构建了TM6SF2 GKO小鼠模型。7周龄TM6SF2 GKO小鼠的体重、肝重和肝指数均高于野生型小鼠。在普通饮食12周后,OGTT试验30分钟时检测到TM6SF2 GKO小鼠的血糖值比正常小鼠显著增加（P=0.022）。并且在高脂饮食12周后,OGTT试验在30分钟和60分钟时检测到TM6SF2 GKO小鼠的血糖值高于正常组小鼠。并且在7周龄,12周普通饮食和高脂饮食条件下,TM6SF2 GKO小鼠的OGTT-AUC均高于对照组野生型小鼠。油红染色结果显示,在12周高脂饮食诱导后,TM6SF2 GKO小鼠肝细胞中的脂滴含量和面积明显高于野生型小鼠。HE染色结果显示,在12周的高脂饮食诱导后,TM6SF2 GKO小鼠的肝脏组织呈大泡性脂肪变性,病理损伤比正常小鼠更加严重。此外,对12周高脂饮食诱导的小鼠小肠组织进行油红染色和HE染色观察发现,TM6SF2GKO小鼠的小肠上皮细胞中脂滴面积和数量比正常小鼠明显增多。结论:我们首次应用CRISPR/Cas9基因重组技术成功构建了TM6SF2基因肠道特异性敲除的小鼠模型。TM6SF2肠道特异性敲除导致成年小鼠的体重、肝重和肝指数较野生型小鼠明显增加。在成年小鼠、高脂饮食和普通饮食喂养12周条件下,TM6SF2肠道特异性敲除会损伤小鼠的葡萄糖耐受能力。在高脂饮食条件下TM6SF2肠道特异性敲除能够增加小鼠肝脏的脂肪变性程度及肝脏的炎症状态,促进NAFLD的发生发展。TM6SF2肠道特异性敲除在一定程度上能够增加小肠上皮细胞对脂质的吸收能力。
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