论文部分内容阅读
组织工程支架是组织工程的基础,是组织工程技术的关键因素。支架的性能对于修复受损组织或重建功能具有重要的意义。目前传统方法如模压沥滤法等制备组织工程支架存在操作条件复杂,有机溶剂残留量高,孔洞贯通性差或需要盐析法除去固体致孔剂,负载的生长因子容易失活,同时无法获得与天然细胞外基质相类似的微观纳米拓扑结构等缺点。为克服上述缺点,本研究旨在利用超临界二氧化碳相转化技术,使用碳酸氢铵颗粒和左旋薄荷醇作为双重致孔剂,制备出具有粗糙表面的左旋聚乳酸纳米纤维组织工程支架。此外,探讨聚乳酸支架的生物相容性、不同拓扑结构与细胞相互作用以及对前成软骨细胞C5.18体外成软骨分化潜能的影响。本论文主要包括以下几方面内容:1.聚乳酸纳米纤维组织工程支架的制备及结构表征通过Minitab实验设计,考察碳酸氢铵颗粒尺寸、薄荷醇/聚乳酸质量比以及聚乳酸浓度对支架孔隙率和压缩强度的影响。实验结果表明,在一定的聚合物浓度下,选择合适薄荷醇/聚乳酸质量比,获得的支架具有较高的压缩强度和孔隙率。考察超临界二氧化碳相分离过程中,压力、温度、聚合物浓度以及薄荷醇/聚乳酸质量比等工艺参数对支架形貌的影响。实验发现,通过改变操作压力,可以有效地控制聚合物溶液的分相过程,从而获得具有不同微观纳米拓扑结构的组织工程支架。在合适的压力条件(15 MPa)下,促进聚合物溶液的液-液分相和固-液分相,从而成功制备出具有粗糙表面的纳米纤维支架。操作温度及聚合物浓度对支架形貌影响较小。致孔剂薄荷醇的存在改善了非溶剂的传质环境,有助于在聚合物固化过程中成孔,从而提高了纳米纤维间孔洞的贯通性。气相色谱分析表明,经过超临界二氧化碳流体处理后,支架中致孔剂薄荷醇已经被去除完全,支架中有机溶剂二氧六环残留量小于3 ppm,远低于USP467药典的要求(380 ppm),这体现了超临界相转化技术的独特优势。通过原子力显微镜进一步表征了纳米纤维表面的微观结构。差示扫描量热、衰减全反射傅里叶红外光谱和广角X射线衍射分析证实,经过超临界二氧化碳相转化技术处理后,促进了聚乳酸在结晶过程中发生再结晶现象;同时薄荷醇的存在导致在相分离过程中,聚乳酸的α-型与α’-型晶体发生转化。2.聚乳酸支架生物相容性研究使用L929细胞作为实验细胞模型进行细胞毒性实验,进行Alamar Blue和吖啶橙/溴化乙啶染色,实验结果表明,各实验组中细胞相对增殖率大于80%,制备出的支架细胞毒性较低,属于合格水平。急性全身毒性实验结果表明,小鼠经腹腔注射支架浸提液后,生长状况良好,生命活动正常,说明制备的支架材料为无毒材料。细胞溶血实验结果表明,支架材料溶血率均低于1.5%,具有良好的血液相容性。3.聚乳酸组织工程支架表面拓扑结构与细胞相互作用研究选择三种具有不同结构特征的支架,考察具有不同拓扑结构的支架对蛋白吸附、细胞粘附、增殖以及细胞分泌蛋白情况的影响。蛋白吸附实验结果表明,具有粗糙表面的纳米纤维支架能够提高纳米纤维的比表面积,为蛋白的吸附提供了更多的结合位点,有利于蛋白质的吸附。细胞粘附实验结果表明,在相同的接种时间内,纳米纤维支架能够更快的促进细胞的粘附,接种7小时后,细胞的粘附率为94%,高于其他实验组。细胞增殖及细胞分泌蛋白质实验结果表明,不同拓扑结构支架均具有良好的生物相容性,适合细胞的生长和增殖。特别地,纳米纤维支架由于其具有与天然细胞外基质相类似的结构特征,能够为细胞的生存提供更合适的微环境。4.体外评价C5.18细胞在聚乳酸组织工程支架上的成软骨分化潜能通过诱导C5.18成软骨分化条件的考察,证明成软骨诱导液中地塞米松浓度为10-6 M时,能够更好地促进细胞的成软骨分化。在相同的诱导条件下,进一步考察具有不同拓扑结构的支架对C5.18细胞成软骨分化潜能的差异。实验结果表明,在各实验组支架上细胞分布均匀。特别地,在纳米纤维组支架上细胞出现了团聚现象。随着诱导时间的延长,培养7天后,C5.18细胞在各组支架上分泌糖胺聚糖、胶原蛋白等细胞外基质成分的能力呈现出显著性差异。C5.18细胞在纳米纤维支架上具有最高的表达量。