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目的：本课题以骨吸收为切入点,通过在体和体外实验,研究青娥方对去卵巢骨质疏松模鼠骨组织MMP-2、9、13、OPG、 RANKL的影响及含药血清对破骨细胞分化和骨吸收作用的影响。旨在从破骨细胞性骨吸收角度探讨青娥方防治绝经后骨质疏松症(PMOP)的作用机制,为青娥方在PMOP临床用药提供实验数据。方法：(一)在体实验1.实验动物选择、分组、造模、药物干预及取材：选3月龄清洁级雌性SD大鼠140只,随机分为造模组100只(腹部正中切口,切除双侧卵巢)、假手术组40只(除不摘除卵巢,其余同造模组)。术后12周,两组各处死10只,用骨密度(BMD)、骨组织形态学指标证明模型成立。造模组余鼠90只再随机分成3组(每组30只)：青娥方组、雌激素组、生理盐水组,统一于术后第13周开始灌胃,分别灌服青娥方2.15g/kg/d、雌激素0.05mg/kg/d、生理盐水2ml／只,假手术组余鼠30只亦灌服生理盐水2m1／只,每天一次。于干预4周、8周、12周三批次取材：腹主动脉取血,离心取血清,-20℃冻存待测；分离胫骨、股骨、腰椎等骨组织,-80℃保存待测。2.指标检测：Discovery Wi双能X线骨密度仪测定股骨BMD；胫骨上段常规切片及HE染色,应用Motic Med6.0数码医学图像分析系统,定量分析骨组织形态；IG-A1000N万能材料试验机测定股骨最大载荷力(N), ELISA法检测血清中E2含量；生化法测定血清TRACP活力；第一、二腰椎分别检测MMP-2.9.13、OPG、RANKLmRNA和蛋白的含量。(二)体外实验1.青娥方含药血清制备：选3月龄清洁级雄性SD大鼠20只,随机分为含药血清组和空白血清组,每组10只,分别灌服青娥方2.15g/kg/d,生理盐水2m1/只,灌胃7天,腹主动脉取血制备青娥方含药血清和生理盐水血清。2.指标检测2.1青娥方含药血清对RAW264.7细胞诱导分化的影响：RANKL(30ng/mL)和M-CSF(10ng/mL)诱导RAW264.7细胞,同时分别加入10%生理盐水血清和10%、15%、20%青娥方含药血清,培养2d、4d、6d,动态观察活体细胞的变化；TRACP染色观察破骨细胞数目；生化法测定细胞上清液中TRACP活力；Q-PCR法检测贴壁细胞中PU.1、Mitf、NFATcl mRNA的含量。2.2青娥方含药血清对成熟破骨细胞骨吸收功能的影响：RANKL(30ng/mL)和M-CS F (10ng/mL)诱导RAW264.7细胞,与骨磨片同时培养,7天后经TRACP染色鉴定诱导成功后,分别加入10%生理盐水血清和10%、15%、20%青娥方含药血清,培养24h、48h、72h,动态观察活体细胞的变化；甲苯胺蓝染色观察骨磨片上骨吸收陷窝数目；生化法测定细胞上清液中TRACP活力；Q-PCR法检测贴壁细胞中TRACP、RANK、MMP-9mRNA的含量。结果：(一)在体实验(在灌胃和取材过程中实验大鼠共死亡15只)1.术后12周大鼠PMOP模型的鉴定：术后12周,模型组股骨BMD和血清E2含量明显低于假手术组(P<0.01)；模型组骨小梁变细变稀,分布散乱,出现中断,间距增大,呈现典型的骨质疏松松质骨的病理形态改变；两组骨小梁面积百分比相比有显著性差异(P<0.01)。2.骨密度测定：药物干预后,两药物组股骨BMD呈上升态势,高于同期生理盐水组(P<0.01或P<0.05)。低于同期假手术组,但无统计学意义(P>0.05)。两药物组相比,BMD指标差异不大(P>0.05)。3.骨组织形态学分析：药物干预后,假手术组骨小梁分布均匀,排列规则,小梁间隙正常。生理盐水组变化明显,骨小梁变细变稀,分布散乱,边缘粗糙,完整性差,呈碎片、断裂现象。与同期生理盐水组比,两用药组骨小梁数目略多,结构完整性明显优于生理盐水组,骨小梁面积百分比亦明显高于同期生理盐水组(P<0.01),但不及假手术组。两药物组相比,雌激素组略高于青娥方组,12周时差异有统计学意义(P<0.05)。4.骨生物力学结果：卵巢摘除后12周模型组股骨的最大载荷力明显低于假手术组(P<0.01)。药物干预后,两用药组股骨最大载荷力均高于同期生理盐水组(P<0.01或P<0.05),但仍低于同期假手术组(P<0.01或P<0.05)。雌激素组股骨最大载荷力高于同期青娥方组,12周时差异有统计学意义(P<0.01)。5.血清E2测定：药物干预后,两用药组血清E2浓度均明显上升,高于同期生理盐水组(P<0.01或P<0.05),且与同期假手术组无明显差异(P>0.05)。从数值上看,青娥方组低于同期雌激素组,8、12周时差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。6.血清TRACP活力测定：术后12周模型组血清TRACP活力明显强于假手术组(P<0.01)。药物干预后,两用药组血清TRACP活力出现下降,青娥方组在三个时间点与同期生理盐水组相比都有统计学意义(P<0.05)。7.骨组织MMP-2、9、13和RANKLmRNA和蛋白含量结果：切除卵巢12周后模型组骨组织的MMP-2、9、13和RANKLmRNA和蛋白表达量明显高于假手术组(P<0.01)。用药后两药物组呈持续下降,三个时间点均低于同期生理盐水组(P<0.01),除MMMP--13外,其余都明显高于同期假手术组(P<0.01)。8.骨组织OPGmRNA和蛋白含量结果：卵巢摘除12周后,模型组骨组织OPGmRNA和蛋白含量高于假手术组(P>0.05)。用药后两药物组指标含量明显高于同期生理盐水组(P<0.01),但低于同期假手术组(P<0.01)。(二)体外实验与生理盐水血清组相比,各用药组破骨样细胞数目,骨吸收陷窝数目,细胞上清液TRACP活力,细胞中PU.1、Mitf、NFATcl、TRACP、RANK、MMP-9mRNA表达量均随用药浓度的递增逐渐减少,差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。结论：1.青娥方能明显抑制破骨细胞性骨吸收作用。2.青娥方对破骨细胞性骨吸收的抑制作用与其提高去卵巢大鼠血清E2水平,下调骨组织RANKL/OPG比值和MMP-2、9、13表达,以及降低破骨细胞PU.1、Mitf、NFATcl、 TRACP、RANK、MMP-9mRNA表达,减少RANKL与RANK结合密切相关。