论文部分内容阅读
原生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)是一种来源于胚胎原始生殖嵴并具有多向分化潜能的干细胞,是二倍体生物生殖细胞的前体,只短暂的存在于胚胎中,最终分化发育为生殖细胞。对于原生殖细胞的深入研究,对于体外胚胎发育研究、基因研究、基因组学研究、药物筛选等具有重要意义。vasa基因最早在果蝇中发现,它对极颗粒的形成和生殖细胞的发育起着至关重要的作用,已有研究表明,vasa基因突变的个体将不能生成生殖细胞。在绝大多数物种中,vasa基因高度保守,且仅限在生殖细胞中特异性表达,因此它可以作为一种分子标记用于研究配子发生及原生殖细胞的起源、迁移、分化等。
本文对家蚕vasa-like gene基因(Bombyxmori vasa-like gene,Bmvlg)的功能做了初步研究,构建了由.Bmvig启动子驱动的Bmvlg和DsRed的融合表达转基因载体,通过精子介导法获得了转基因家蚕,荧光显微镜观察可检测到明显的荧光蚕,表明转基因家蚕构建成功,同时在家蚕的未受精卵中可观测到绿色荧光和红色荧光,表明Bmwlg是一种母源性基因。将Bmvlg基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,在E coli中成功表达了BmVLG,并利用镍离子柱纯化的重组蛋白免疫小鼠制备了多克隆抗体；利用该抗血清的western blotting分析结果显示,在家蚕精巢和卵巢中检测到了大小约为70 kDa.特异性条带；免疫荧光细胞定位结果显示,BmVLG蛋白主要在BmN培养细胞中的细胞质中表达:qRT-PCR结果显示,BmVLG基因在家蚕四龄和五龄的性腺中均有表达,且无明显差异。这些结果为进一步研究BmVLG的功能奠定了基础。Vis(Vismay)属于TGIF家族,在果蝇中的研究表明,Vis缺失的果蝇突变体能够存活,但是雄性果蝇表现出不育的表型,已有研究表明Vis是一种减数分裂阻滞基因。在家蚕中通过RT-PCR.克隆了长度为847 bp的vis基因(Bmvis)片段,并对其进行了结构分析和进化树分析；在家蚕各种组织中的表达检测显示,Bmvis基因仅在家蚕的精巢中表达；亚细胞定位分析显示BmVis蛋白在细胞核和细胞质中均匀表达,但主要分布在细胞核中。研究结果为深入了解家蚕中BmVis的功能奠定了基础。