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目的： 本研究在前期工作的基础上，以miR-15a/16-1敲除鼠为主要研究对象，探讨CD19+Tim-1+B细胞的生物学功能以及对肝癌生长的影响。以期明确miR-15a/16-1在肝癌中的作用并揭示其机制，为阐明肝癌的发病机制及临床治疗提供实验基础。 方法: 1.检测miR-15a/16-1-/-小鼠脾脏中调节性B细胞频率变化及其作用 1.1 检测miR-15a/16-1-/-小鼠脾脏中B细胞频率变化及其分泌的细胞因子IL-10的变化 分别制备8-12周龄和15-18月龄miR-15a/16-1-/-小鼠和WT小鼠脾脏单细胞悬液，流式细胞术检测脾脏中B220+CD19+细胞亚群频率。用磁珠分选出CD19+细胞后经LPS刺激0h、24h、48h后收集培养上清，ELISA法检测上清中IL-10的浓度。流式细胞术检测15-18月龄miR-15a/16-1-/-小鼠脾脏CD19+细胞内IL-10的表达。 1.2 检测不同周龄miR-15a/16-1-/-小鼠脾脏中CD19+Tim-1+、CD19+FcγRⅡbhi及CD19+CD5+CD1dhi细胞频率 取8-12周龄和15-18月龄miR-15a/16-1-/-小鼠脾脏制备成单细胞悬液，流式细胞术分别检测脾脏CD19+Tim-1+，CD19+FcγRⅡbhi及CD19+CD5+CD1dhi细胞亚群频率，再用胞内染色法检测CD19+Tim-1+细胞内IL-10的表达。 1.3 检测荷瘤后的8-12周龄miR-15a/16-1-/-小鼠脾脏中调节性B细胞亚群频率 8-12周龄miR-15a/16-1-/-小鼠经H22小鼠肝癌细胞荷瘤，3周后检测脾脏中调节性B细胞亚群频率，并用胞内染色检测其分泌IL-10情况。 1.4 检测CD19+Tim-1+细胞对CD4+T细胞的作用 将CD19+Tim-1+细胞和CD4+T细胞以1∶1的比例进行混合培养，72小时后，流式细胞术检测CD4+T细胞CD69的表达和IFN-γ分泌情况;在CD4+T细胞和CD19+Tim-1+细胞共培养体系中加入IL-10的中和性抗体观察CD4+T细胞表面CD69的表达和IFN-γ分泌情况。 2.CD19+Tim-1+B细胞对肝癌生长的影响 2.1 检测肝癌病人外周血调节性B细胞的频率 人体内调节性B细胞主要为CD19+C24hiCD38hi细胞，收集临床肝癌病人治疗前的外周血，用Perco11梯度离心分离外周血淋巴细胞，用流式细胞仪检测CD19+C24hiCD38hi调节性B细胞频率。 2.2 观察CD19+Tim-1+细胞对移植瘤小鼠肿瘤生长的影响 分选15-18月龄的miR-15a/16-1-/-小鼠脾脏中CD19+Tim-1+细胞和CD19+Tim-1-细胞，分别过继输入H22移植瘤小鼠（5×105细胞/200μl/只）。每3天过继输入一次，共三次。观察移植瘤小鼠的肿瘤生长情况，记录下肿瘤生长曲线。三周后处死小鼠，剥离肿瘤组织并记录肿瘤体积。 3.探讨CD19+Tim-1+B细胞发挥负向作用的机制 3.1 STAT3信号通路的检测 制备15-18月龄的野生型和miR-15a/16-1-/-小鼠脾脏单细胞悬液，分选CD19+Tim-1+细胞，提取总蛋白后Western Blot法检测胞内STAT3，pSTAT3Tyr705和pSTAT3ser727的表达。 3.2 STAT3抑制剂对CD19+Tim-1+细胞中IL-10分泌的影响 分选15-18月龄的野生型和miR-15a/16-1-/-小鼠脾脏CD19+Tim-1+细胞，加入STAT3抑制剂共培养8小时后，流式细胞仪检测CD19+Tim-1+细胞内IL-10的表达。 3.3 miR-16过表达对STAT3表达的影响 使用生物信息分析软件查找miR-16与STAT3之间的关系;分选15-18月龄的野生型和miR-15a/16-1-/-小鼠脾脏CD19+Tim-1+细胞，pro-miR-16慢病毒感染后，Western Blot法检测CD19+Tim-1+细胞中STAT3的表达。 研究结果: 1.15-18月龄miR-15a/16-1-/-小鼠脾脏中调节性B细胞频率增高 1.1 15-18月龄miR-15a/16-1-/-小鼠脾脏中B细胞频率增高且高分泌IL-10 与同龄野生型小鼠相比，15-18月龄的miR-15a/16-1-/-小鼠脾脏中B220+CD19+细胞亚群频率显著增高，且该细胞高分泌IL-10，而8-12周龄小鼠的B220+CD19+细胞频率无明显差异。15-18月龄miR-15a/16-1-/-小鼠的CD19+细胞经LPS刺激48h后培养上清中IL-10含量显著增高。以上结果说明15-18月龄miR-15a/16-1-/-小鼠脾脏中分泌IL-10的调节性B细胞增多，而在8-12周龄的miR-15a/16-1-/-小鼠无变化。 1.2 15-18月龄miR-15a/16-1-/-小鼠脾脏中CD19+Tim-1+细胞频率增高 进一步分析15-18月龄miR-15a/16-1-/-小鼠脾脏中调节性B细胞亚型，显示15-18月龄miR-15a/16-1-/-小鼠脾脏中的CD19+Tim-1+细胞频率较野生型小鼠显著增高，且高分泌IL-10，而CD19+FcγRⅡbhi及CD19+CD5+CD1dhi细胞亚群频率无明显差异。此结果说明miR-15a/16-1缺失可以诱导15-18月龄小鼠体内CD19+Tim-1+细胞的产生。 1.3 8-12周龄miR-15a/16-1-/-小鼠荷瘤后脾脏中CD19+Tim-1+细胞频率增高 8-12周龄miR-15a/16-1-/-小鼠皮下种植H22癌细胞3周后，脾脏中CD19+Tim-1+细胞频率较同龄野生荷瘤鼠显著增高，此结果说明小鼠肝癌可以引起8-12周龄miR-15a/16-1-/-小鼠中CD19+Tim-1+细胞增多。 1.4 CD19+Tim-1+细胞抑制CD4+T细胞的活性 CD4+T细胞与CD19+Tim-1+B细胞共培养72小时后，CD4+T细胞CD69表达量和IFN-γ分泌量显著下调，说明CD19+Tim-1+B细胞抑制CD4+T细胞的活性。但该抑制效应可被IL-10中和性抗体逆转，提示CD19+Tim-1+细胞可能通过分泌IL-10发挥抑制效应。 2.CD19+Tim-1+细胞可促进小鼠肝癌的生长 2.1 肝癌病人外周血中调节性B细胞频率增高 肝癌患者治疗前外周血中调节性B细胞频率较正常人显著增高，提示调节性B细胞可能参与肝癌的发生与发展。 2.2 过继输入CD19+Tim-1+细胞可以促进肿瘤生长 过继输入CD19+Tim-1+细胞的荷瘤小鼠肿瘤生长速度及体积均显著大于CD19+Tim-1-细胞过继输入组小鼠，说明CD19+Tim-1+细胞可以促进肝癌的生长。 3.miR-15a/16-1可以通过STAT3通路发挥负向调节作用 3.1 miR-15a/16-1-/-小鼠CD19+Tim-1+细胞中STAT3表达增高 我们用Western Blot法在蛋白水平研究miR-15a/16-1的调控信号通路，结果发现miR-15a/16-1-/-小鼠CD19+Tim-1+细胞中STAT3，pSTAT3Tyr705，pSTAT3scr727的表达较野生鼠显著上调。 3.2 STAT3抑制剂下调miR-15a/16-1-/-小鼠脾脏CD19+Tim-1+细胞IL-10的分泌 MiR-15a/16-1-/-小鼠脾脏CD19+Tim-1+细胞经STAT3抑制剂处理后，其胞内IL-10分泌量显著下降。进一步印证STAT3信号通路的表达变化可影响CD19+Tim-1+细胞IL-10的分泌。 3.3 miR-16慢病毒过表达后STAT3的表达下降 生物信息软件显示miR-16直接绑定于STAT3的3端非编码区，CD19+Tim-1+细胞中miR-16过表达后检测STAT3的表达，发现实验组的STAT3表达较对照组明显下调，此结果说明进一步CD19+Tim-1+细胞可能通过STAT3通路发挥促进肿瘤生长的作用。 结论: 1)肝癌患者外周血中调节性B细胞频率增高; 2)CD19+Tim-1+细胞可以促进肝癌的生长; 3)miR-15a/16-1可通过STAT3信号通路抑制CD19+Tim-1+细胞分泌IL-10，从而发挥肿瘤抑制作用。