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固有免疫（innate immunity）是抗病毒感染的第一道防线。固有免疫细胞通过模式识别受体（pattern recognition receptor，PRRs）如TLRs、RLRs等识别病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP),激活下游的信号通路，分泌抗菌肽、I型干扰素（IFN-I）、多种细胞因子发挥局部抗感染作用，同时激活树突状细胞（DC）和巨噬细胞的抗原提呈功能诱生适应性免疫。在抗病毒固有免疫中，I型干扰素（IFNα/β）是至关重要的早期抗病毒效应分子，IFN-I又通过激活多种I型干扰素诱导基因（ISGs）的表达，激活放大抗病毒免疫效应。干扰素调控分子3（IFN regulatory factor,3IRF3）是抗病毒IFN I通路的关键信号分子，则病毒和宿主均可能通过对IRF3的蛋白或功能调节实现对I型干扰素通路的最有效拮抗和促进作用。 三结构域（TRIMs）蛋白家族是一个近年发现的抗病毒蛋白明星家族，因其N-端三个保守结构域RING、B-Box、Coiled-coil而命名。TRIMs家族蛋白在细胞增殖、分化、凋亡、癌变等过程中发挥重要作用；TRIMs多由I型干扰素诱导产生，近年发现其对病毒复制具有限制作用。TRIM5a可阻断逆转录病毒如 HIV-1的复制和感染；TRIM19则对RNA病毒如流感病毒具有广谱抑制作用，提示TRIM家族蛋白是一群广谱的抗病毒分子。 TRIM21(Ro52/SS-A)最初发现为自身免疫患者血清自身抗原，而近年发现其具有抗病毒或促病毒作用：TRIM21可抑制HIV和鼠腺病毒MAV病毒复制，但也可促进单纯疱疹病毒HSV-1的感染。TRIM21是一种泛素化E3连接酶，其可诱导干扰素调控分子（IRF3/7）和DNA感受器如DDX41的泛素化并经蛋白酶体降解提示它是重要的IFN I通路和抗病毒固有免疫调控分子。TRIM21同时为胞浆IgFc受体，可经FcR结合已感染进入胞浆的IgG-病毒，发挥抗体依赖的细胞内中和效应(antibody-dependentintracellularneutralization，ADIN)。目前TRIM21的研究存在三方面的不足：1）TRIM21的诱导表达机制；2）绝大多数TRIM21研究为体外细胞学研究，缺乏体内证据提示其生理学功能；3）TRIM21的组织表达格局与生理状态下的免疫调节功能。 本研究关注的对象为B3型柯萨奇病毒（CoxsackievirusB3,CVB3），隶属于肠道病毒（enterovirus）属小核糖核酸（RNA）病毒科（picomaviridae）无衣壳正链RNA病毒。其经粪口途径先感染肠道，而后累及心脏、胰腺、肝脏等多脏器，诱导病毒性心肌炎（Viral myocarditis，VMC）、胰腺炎等；在上世纪末是致病毒性心肌炎的最主要病毒。急性心肌炎易进展为慢性心肌炎、扩张性心肌病和心衰，是导致青少年及运动员猝死和心脏移植的主要因素。目前有关急性VMC（4-12天）的发病机制，认为由早期的 CVB3直接裂解心肌细胞和随后诱导的炎症细胞浸润及其炎症损伤效应所介导。 本研究我们关注TRIM21对CVB3感染及其诱导的病毒性心肌炎的作用，基于以下预实验数据及科学线索：1）CVB在肠道组织实施初级复制，其复制曲线类同心脏，即第3-4天达高峰，第7天降至本底，但其肠道复制规模显然受限，载量低于心脏载量3-4个数量级；共受体DAF的表达高低不能解释；2）CVB3肠道感染诱导了低水平炎症固有免疫（IL-17A、TNFa）并诱导轻微肠道损伤；3）TRIM21在肠道和心脏天高表达，且CVB3诱导表达显著高于心脏；4）TRIM21的表达与CVB3复制动力学一致，第3天达高峰；5）TRIM21表达于心肌细胞胞浆，且与CVB3 RNA发生共定位；6）CVB3感染诱导肠道SIgA分泌，而TRIM21是胞浆Ig FcR；7）TRIM21被报道为IFN-I通路调控分子，而CVB3天然抑制IFNβ的早期分泌。由此我们提出假设：肠道和心脏不同的区域I型干扰素应答格局，可能决定了CVB3在不同脏器的差异性复制与炎症损伤；肠道TRIM21的优势和上调表达，可能通过其IFN-I通路调节抗病毒功能和依赖肠道SIgA的胞内中和效应，实现对CVB3体内外感染复制的阻断和对病毒性心肌炎的保护。 综上，为阐明作为肠道病毒的CVB3，在初始感染器官肠道的复制和组织炎症损伤受限而在次级器官如心脏胰腺的病毒复制和组织损伤严重的现象，是否与肠道天然及诱导性高表达的TRIM21分子的调控IFN-I通路的抗病毒功能密切相关、且是否存在肠道SIgA介导的TRIM21胞内中和效应机制？拟在CVB3感染BALB/c小鼠诱导的病毒性心肌炎模型中，深入系统研究TRIM21的诱导表达谱、其抗病毒功能、其胞内中和病毒效应、及其对IFN-I通路关键信号分子IRF3的调节机制，并通过小鼠体内研究回答肠道和心脏TRIM21的生理抗病毒功能和固有免疫调节意义。该研究未见报道，在TRIM21的组织差异表达的生理抗病毒意义和其IFN-I通路调节机制方面提供了创新性思路和数据。 第一部分、生理和CVB3感染后小鼠组织器官和细胞水平TRIM21的动态表达 一、CVB3感染BALB/c小鼠诱导的急性心肌炎模型 以1500 TCID50剂量CVB3腹腔感染雄性BALB/c小鼠，建立了急性病毒性心肌炎模型，小鼠感染第3天出现消瘦与死亡，7天死亡率约50%；7天体重减轻率约20%；组织病理显示：第7天心脏出现严重炎症浸润及灶性心肌细胞坏死，累及面积为20-60%，肝脏病理类似但略轻微，而小肠仅固有层增厚和少量炎症浸润（<10%）。提示CVB3感染小鼠差异诱导了不同脏器的感染与炎症损伤。 二、CVB3感染后在心脏、肠道、肝脏呈差异性复制 检测CVB3感染小鼠心脏、小肠和肝脏组织的CVB3的+链（载量）和-链（复制）RNA水平，发现：各脏器的病毒复制动力学一致，均在第3天快速上升至峰值，而后降低至本底；7天心脏病毒载量显著升高300倍（P<0.05），小肠复制最低，提示CVB3感染小鼠后心脏高复制而在小肠呈低复制。 三、CVB3感染诱导的不同组织TRIM21表达谱系 为研究TRIM21在各脏器的生理表达和CVB3的诱导表达谱系，取CVB3感染心脏、肝脏、脾脏、小肠、结肠组织，检测0、3、7、21天TRIM21的RNA和蛋白表达。RT-PCR显示：1）TRIM21在小肠具有高于其他器官的 TRIM21本底表达；2）CVB3感染后，小肠、心脏和肝脏的TRIM21表达显著增高，感染3天的小肠TRIM21上调最为显著（6倍，p<0.05）；3）小肠、心脏和肝脏的TRIM21表达动力学相似，感染第3天显著增高并达峰值。免疫组化证实：感染第3天，TRIM21在心脏、肝脏和小肠组织均有显著上调表达。提示TRIM21也呈现组织器官差异性天然和诱导表达。 四、TRIM21表达于原代心肌细胞和肠道上皮细胞并与CVB3共定位 既然CVB3在感染小鼠的心脏和肠道呈现显著差异表达，则进一步多色荧光染色检测体外的原代心肌细胞、肠道上皮细胞的 TRIM21的表达及细胞定位。发现：原代心肌细胞中，TRIM21天然表达于心肌细胞胞浆，CVB3感染显著上调TRIM21的表达，且TRIM21与CVB3 RNA呈现显著的共定位现象。肠道上皮细胞的试验尚在进行中。提示TRIM21表达于心肌细胞，被CVB3感染显著上调的同时可能与CVB3直接作用。 第二部分、TRIM21通过RING结构域发挥直接抗CVB3复制效应 一、TRIM21过表达质粒p-Flag-TRIM21的克隆与过表达效率 为体外研究TRIM21对CVB3的抗病毒作用，构建了人的TRIM21过表达质粒p-Flag-TRIM21，酶切和测序鉴定成功。为验证该质粒的转染效率，以lipo2000将pTRIM21转染HeLa细胞,48h检测发现: pTRIM21质粒转染细胞可显著上调TRIM21的mRNA和蛋白表达。 二、过表达TRIM21可显著抑制CVB3的体外细胞水平复制 为明确胞浆TRIM21对CVB3的作用，以体外人Hela细胞体系，转染过表达人TRIM21质粒，24h后感染CVB3，从多水平检测过表达TRIM21对于CVB3体外复制的影响。 1、过表达TRIM21显著抑制CVB3 RNA水平：检测病毒载量（+链）和RNA复制（-链）水平，证实过表达人TRIM21在感染后12小时起即抑制病毒RNA，24小时显著抑制病毒RNA水平(p<0.05)；48小时CVB3载量降至对照1/3以下。 2、过表达TRIM21显著抑制CVB3结构蛋白VP1的胞内表达：发现感染24小时胞内病毒蛋白VP1的表达与载体转染组相比显著降低50%以上（p<0.05）。 3、过表达TRIM21显著抑制细胞上清中活性病毒颗粒水平：过表达TRIM21后，24h细胞上清中活性病毒颗粒较对照组显著降低3倍（185000至72000，p<0.05） 4、过表达TRIM21显著抑制CVB3在胞内的活性复制：以带GFP-CVB3感染过表达TRIM21的Hela细胞，荧光显微镜检和流式细胞术均证实过表达TRIM21显著降低了CVB3在Hela细胞的有效复制（GFP+细胞比例,7.8%至4.2%，p<0.01）。 综上，过表达Trim21基因可显著抑制CVB3在体外的RNA水平、蛋白水平、活性蛋白颗粒水平的复制。 三、下调TRIM21表达显著促进CVB3的胞内的复制 为更进一步证明TRIM21对CVB3的抑制作用，通过siRNA下调TRIM21在Hela的表达，而后检测CVB3感染后复制的改变。 1.TRIM21-siRNA可显著下调TRIM21在Hela细胞的表达（50%）。 2.下调TRIM21表达可显著促进CVB3的细胞水平复制：以TRIM21-siRNA转染HeLa细胞24小时，以CVB3（MOI=5）感染，发现:与载体对照相比，下调TRIM21的表达显著促进了CVB3在Hela细胞内的RNA水平和活性病毒颗粒。 四、TRIM21激活I型干扰素信号通路发挥抗病毒效应 为探讨TRIM21抗病毒机制，首先关注TRIM21对于I型干扰素通路的调节。 1、过表达TRIM21可上调细胞内IFNα/β的RNA表达：过表达TRIM21的HeLa细胞感染CVB3，发现过表达TRIM21显著促进CVB3诱导的IFNα/βRNA表达。 2、共转TRIM21可激活IFN-β启动子转录：HEK-293T共转染pTRIM21和IFN-β-luciferase报告质粒，CVB3刺激，36hr检测荧光素酶活性发现：过表达TRIM21显著增强CVB3激活的IFNβ转录（40倍）且具剂量依赖效应。 3、过表达TRIM21可激活I型干扰素通路上下游原件的表达：CVB3刺激的IFN-I上游元件TRIF/TBK1和下游效应分子ISG15/ISG54表达被TRIM21显著上调。 4、共转TRIM21可促进IRF3和NF-KB启动激活：共转pTRIM21和IRF3或NF-KB-luciferase的293T，发现TRIM21显著增强CVB3激活的IRF3/NF-KB转录。 5、TRIM21促进IRF3的磷酸化激活：293T过表达TRIM21，自CVB3感染的1hr-6hr，均可显著增强CVB3激活的IRF3磷酸化。 综上，CVB3感染上调表达的TRIM21可显著激活和促进CVB3诱导的I型干扰素通路IFN-β/IRF3转录及IRF3磷酸化修饰和IFN-I通路多种效应元件分子的表达，发挥抗病毒效应。 五、TRIM21通过RING结构域激活I型干扰素通路抗病毒效应 为研究 TRIM21激活 I型干扰素信号通路和抗病毒复制的关键结构域，构建TRIM21的ΔRING、ΔB-box、ΔPRY/SPRY缺失突变体质粒。 1、各结构域缺失体、TRIM21全长质粒转染Hela，感染CVB3，24hr检测CVB3复制发现：仅缺失RING结构域阻断了TRIM21对CVB3的RNA复制。 2、仅RING结构域缺失阻断了过表达TRIM21所发挥的VP1抑制功能。 3、IFNβ-Luciferase报告质粒研究TRIM21对IRF3、IFNβ的转录激活所依赖结构域，发现：SPRY结构域缺失无影响；B-BOX缺失仅影响IRF3的转录激活；而RING结构域缺失显著阻断了CVB3诱导的IRF3、IFNβ转录激活。 综上，TRIM21通过RING结构域激活I型干扰素通路发挥抗病毒效应。 第三部分、TRIM21抗CVB3复制及病毒性心肌炎的体内作用 为明确TRIM21的体内抗CVB3功能及其对CVB3诱导的病毒性心肌炎的影响，我们制备了TRIM21 KO小鼠（尚未得到）；并构建pTRIM21过表达质粒，通过invivo-jetPEI体内转染脂质体试剂实现体内过表达，再以CVB3感染，检测TRIM21体内过表达对于CVB3复制、病毒性心肌炎的可能作用。 一、小鼠TRIM21过表达质粒的构建和体内上调效率 构建了小鼠TRIM21的全长pCDNA3.1-Flag-mTRIM21过表达质粒，经酶切和测序鉴定为正确。可实现TRIM21的体内过表达，采用InvivoJET-PEI技术将TRIM21质粒与PEI试剂混合，于-1和+1天两次以眼眶静脉途径注射小鼠，检测心脏TRIM21的RNA上调表达效果，发现，给予过表达质粒的第3、7天，与对照质粒相比，心脏TRIM21RNA的表达均显著上调（P＜0.001）。 二、体内上调TRIM21显著改善CVB3感染小鼠的生存状态 为在CVB3急性病毒性心肌炎小鼠中探讨TRIM21的体内抗病毒功能，采取如下流程：-1/1天注射PEI-pTRIM21，第0天感染1500 TCID50剂量CVB3，观察小鼠存活率至第7天。发现：1）对照小鼠和空质粒小鼠3天起发病严重，7天生存率50%；而TRIM21过表达组状态明显改善，生存率提升至60%（p<0.05）；2）对照和空质粒小鼠体重减轻率达25%，而 TRIM21过表达组体重减轻率显著下降为17%（p<0.05），提示过表达TRIM21对CVB3感染发生保护作用。 三、体内过表达TRIM21显著抑制CVB3体内复制 在过表达TRIM21的小鼠心脏中，检测病毒感染第3、7天病毒RNA和活性效价，结果显示：感染第3天，CVB3复制高峰期，与对照组相比，过表达TRIM21小鼠1）显著降低心脏病毒RNA载量（+链）和复制（-链）（P＜0.001, p<0.05）。2）显著降低心脏病毒颗粒效价由7x105至2x105（P＜0.05）；3）显著增高小鼠心脏IFNβ RNA表达约3倍（P＜0.001)，提示过表达TRIM21通过促进心脏局部表达IFNβ抑制体内病毒复制。 四、体内过表达TRIM21显著减轻急性病毒性心肌炎 为研究 TRIM21过表达对于心肌炎发病的影响，感染第7天发现：1）心脏H.E病理显示：对照小鼠心脏可见显著的炎症浸润灶及心肌细胞坏死；过表达TRIM21则显著减少心脏灶性炎症浸润，病理评分显著降低（P＜0.05）；2）ELISA检测感染心脏匀浆细胞因子水平发现，CVB3感染诱导心脏各炎症因子（TNFα、IL-1、IL-6）显著上调，而体内过表达TRIM21显著降低心肌炎症细胞因子水平（P＜0.001）。提示过表达TRIM21显著减轻急性病毒性心肌炎。 综上，本研究以抗病毒固有分子及胞浆Fc受体TRIM21为研究对象，系统研究了其在无包膜小RNA病毒-B3柯萨奇病毒（CVB3）感染复制及其诱导的病毒性心肌炎中的作用，创新性发现：CVB3感染诱导心脏和肠道TRIM21表达显著上调；TRIM21通过RING结构域激活IRF3磷酸化从而I型干扰素通路发挥体外抗病毒效应；小鼠体内过表达 TRIM21证实其体内抗病毒效应和对病毒性心肌炎的保护作用；TRIM21作为IgA/IgG的高亲和FcR，还识别激活了肠道IgA/血清IgG-CVB3胞内摄取所介导的细胞内中和效应（ADIN）。本研究系首次研究TRIM21在正链小RNA病毒CVB3体内外感染中的抗病毒作用和抑炎作用，且阐明其激活IRF3-IFN-I通路和介导ADIN的两条独立机制，拓展了TRIM21作为I型干扰素通路调控分子和新型胞浆innate sensor的免疫理论。 第四部分、TRIM21抑抗CVB3复制的抗体依赖机制 CVB3可诱生肠道特异性SIgA，CVB3对胰腺和心脏的亲嗜性最高而对小肠的亲嗜性最低，提示小肠上皮细胞或免疫细胞有特别机制可限制CVB3复制。因TRIM21被报道为胞浆高亲和Ig Fc受体，推测肠道SIgA结合肠道CVB3可能转运至肠道上皮细胞内部激活TRIM21诱导胞内中和ADIN效应。 一．CVB3感染小鼠后血清IgG和肠道SIgA显著增高 首先，检测CVB3感染小鼠0/7/14/21天CVB3结构蛋白VP1特异性抗体结果显示：血清IgA和肠道IgA均被CVB3有效诱导，约在14天达高峰。 二、原代小鼠胚胎成纤维（MEF）细胞培养和TRIM21的诱导表达 取妊娠13-14.5天的鼠胚胎，经培养获得原代小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），细胞呈梭型，活力高，作为模拟肠道微环境且支持 CVB3复制的细胞。以CVB3（MOI=5）刺激，发现感染1-2天MEF内TRIM21的表达水平显著增高。 三、MEF胞浆TRIM21可高效辅助SIgA发挥细胞内中和病毒效应（ADIN) 1、血清IgG和肠道IgA预孵育CVB3均在MEF细胞内发挥ADIN效应：为明确胞浆TRIM21是否可发挥抗体介导的细胞内中和CVB3效应，取感染14天血清IgG和肠液IgA，预先1:1与CVB3孵育1小时，后感染MEF细胞，发现：与CVB3直接感染24小时显著增高的病毒RNA水平相比，预孵育血清IgG或肠道SIgA的CVB3在MEF的复制显著降低90%以上。 2、IgA/IgG-CVB3的ADIN效应依赖于TRIM21：为证实上述ADIN效果出于MEF胞浆TRIM21的作用，先以TRIM21功能阻断剂DbeQ阻断2小时，再以SIgA/IgG- CVB3感染MEF细胞，发现：TRIM21阻断剂 DbeQ显著阻断了IgA+CVB3的胞内抗病毒效应（80%-100%）；而部分阻断了IgG+CVB3的胞内抗病毒效应（20%-50%）。提示TRIM21介导辅助了ADIN胞内中和CVB3效应且IgA的ADIN效应显著高于血清IgG。