论文部分内容阅读
帕金森病(Parkinsonsdisease，PD)的主要病理改变为中脑黑质多巴胺(dopamine，DA)能神经元进行性变性缺失、变性神经元胞浆内出现嗜酸性包涵体(Lewy体)且伴随有小胶质细胞(microglia)增生。PD发病的确切原因和机制尚未明了，但很多学者认为氧化应激(oxidativestress)在DA能神经元变性过程中有重要影响。有研究表明，小胶质细胞介导的免疫炎症反应和Lewy体的主要成分α-突触核蛋白(α-synuclein)通过各自的途径参与了这一过程。首先，α-synuclein能够诱导细胞内活性氧产物(reactiveoxygenspecies，ROS)水平升高并降低细胞内DA囊泡的数量，进而引起囊泡循环不足导致细胞内DA浓度升高，加剧氧化应激；其次，中枢神经系统的小胶质细胞在病理条件下能够由静息状态转入激活状态，释放出多种炎性因子、一氧化氮(nitrousoxide，NO)及ROS，促进氧化应激的进一步发展。最新的研究发现，α-synuclein能够激活小胶质细胞并诱导其释放ROS，而小胶质细胞释放的炎症因子(如白介素-1)也能够促进α-synuclein的表达。这些现象说明，激活的小胶质细胞与α-synuclein可能存在着相互作用关系，并共同参与着氧化应激的发生和发展。
为研究小胶质细胞介导的免疫炎症反应对DA能神经元的损伤作用，本实验体外培养小胶质细胞，再用LPS进行激活，检测其培养基中肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α，TNF-α)和NO的含量。收集激活及未激活的小胶质细胞条件培养基并分别作用于多巴胺能神经元MN9D、胆碱能神经元NG108-15以及中脑神经前体细胞RMN24h、48h和72h后，通过细胞计数、细胞活性检测、实时定量PCR、硫磺素S染色及超氧化物岐化酶(SOD)活性检测，探讨激活的小胶质细胞条件培养基对多巴胺能神经元的特异性神经毒性作用、α-synuclein的表达和聚集情况以及氧化应激水平。此外，本实验还在三种不同细胞培养基中加入不同浓度的α-synuclein蛋白单体，在不同时间点对细胞数量和活性进行了检测。
结果显示，体外培养的小胶质细胞纯度可达94％以上，LPS(1ng/ml)激活24h后TNF-α和NO分泌量分别为231.25pg/ml和14.49μmol/L，其培养上清液作用于三类细胞24h后细胞活性降低40％以上，48h降低32.6-40.1％，72h时MN9D、NG108-15和RMN细胞活性则分别升高了34.4％、48.8％和13.5％；当上清液稀释50％作用时则只使MN9D和RMN细胞活性降低。三类细胞数量在2448h减少5-14.2％，72h则恢复正常。条件培养基作用24-72h后，MN9D细胞胞内DA及其代谢产物含量分别降低了41.9％、78.9％和22.6％，并促进MN9Dα-synucleinmRNA的表达，到72h时是对照组的2.86倍，但对α-synuclein的聚集无明显影响；72hSOD活性显著降低。
α-synuclein蛋白单体(100ng/ml)作用于MN9D细胞24h后细胞活性降低，较高浓度(1μg/ml)时RMN和NG108-15细胞的活性也受到影响。当50μg/ml作用72h时MN9D细胞数量减少，其胞内DA及其代谢产物含量也明显降低；而NG108-15细胞数量变化不明显，且48h时反而增多；RMN细胞开始减少，48h以后变化不明显。
以上结果表明，小胶质细胞激活对多巴胺能神经元、胆碱能神经元及中脑神经前体细胞均可产生毒性作用，但多巴胺能神经元更敏感。胞外添加α-synuclein蛋白对三类细胞均起到损伤作用，而对多巴胺能神经元的损伤同样更为明显。