论文部分内容阅读
目的通过建立大鼠脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型,观察同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)对局灶性脑缺血大鼠神经细胞凋亡及内源性神经干细胞(neural stem cells,NSCs)增殖分化的影响,通过甲基化阻断剂阿扎胞苷(azacitidine,Azac)和Hcy干预探讨Hcy通过DNA甲基化途径对NSCs增殖分化的作用机制。方法120只成年雄性SD大鼠随机分为假手术组(sham operation,SO组)、大脑中动脉栓塞模型组(middle cerebral artery occlusion group,MCAO组)、同型半胱氨酸+大脑中动脉栓塞模型组(Hcy+middle cerebral artery occlusion group,Hcy+MCAO组)、阿扎胞苷+大脑中动脉栓塞模型组(Azac+middle cerebral artery occlusion group,Azac+MCAO组)以及同型半胱氨酸+阿扎胞苷+大脑中动脉栓塞模型组(Hcy+Azac+middle cerebral artery occlusion group,Hcy+Azac+MCAO组),每组24只。SO、MCAO组按照5 mL/kg·bw·d的剂量腹腔注射生理盐水,Hcy+MCAO组按照5 mL/kg·d的剂量腹腔注射2%Hcy溶液,Azac+MCAO组注射0.05%Azac溶液5 mL/kg·d,Hcy+Azac+MCAO组注射2%Hcy和0.05%Azac混合溶液5 mL/kg·d,预干预7 d后进行MCAO手术,MCAO手术后7 d采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法染色检测大鼠脑梗死体积,TUNEL染色法检测神经细胞凋亡率,HE染色观察脑组织病理改变,采用高效液相法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)检测大鼠血浆中Hcy、SAM和SAH浓度,免疫荧光标记法检测Hcy在脑组织中的分布,采用DNA甲基化定量试剂盒检测不同组别大鼠大脑组织中的DNA总甲基化水平,脑组织DNMTs总活采用甲基转移酶活性检测试剂盒检测。DCX/BrdU、NeuN/BrdU免疫荧光双标记法检测MCAO后7 d内源性NSCs增殖迁移情况,MCAO后14 d检测内源性NSCs分化情况,及对应时间点的增殖迁移神经干细胞和分化神经元细胞中的5mC水平。结果通过Hcy、Azac干预大鼠并建立MCAO模型,TTC染色发现Hcy+MCAO、Azac+MCAO及Hcy+Azac+MCAO组大鼠脑梗死体积比MCAO大,差异具有统计学意义(P<0.05)。TUNEL染色结果显示Hcy+MCAO、Azac+MCAO及Hcy+Azac+MCAO组大鼠大脑神经细胞凋亡率与MCAO组相比升高(P<0.05)。DNA总甲基化水平检测结果表明:Hcy+MCAO、Azac+MCAO和Hcy+Azac+MCAO组脑组织DNA总甲基化降低,与MCAO组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。DNMTs总活性检测结果显示:Hcy+MCAO、Azac+MCAO和Hcy+Azac+MCAO组DNMTs活性下降,与MCAO组比较差异均有有统计学意义(P<0.05),DNMTs活性在各干预组间无明显差异。免疫荧光结果显示:Hcy+MCAO和Hcy+Azac+MCAO组脑组织中皮层与海马均可见Hcy富集。HPLC检测发现,Hcy+MCAO和Hcy+Azac+MCAO组与另外三组相比,大鼠血浆Hcy和SAH浓度显著升高,SAM/SAH比值降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光检测结果显示:MCAO组皮质区和海马区DCX+/BrdU+、Neu N+/BrdU+、DCX+/5mC+、NeuN+/5mC+细胞数量比SO组多,差异具有统计学意义(P<0.05),而Hcy+MCAO、Azac+MCAO和Hcy+Azac+MCAO组皮质区和海马区DCX+/BrdU+、NeuN+/BrdU+、DCX+/5mC+、NeuN+/5mC+细胞数量均少于MCAO组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论成功建立大鼠大脑中动脉栓塞模型来模仿临床脑缺血病理,结果发现Hcy能增加脑梗塞大鼠的脑损伤程度,使MCAO大鼠脑组织神经细胞细胞凋亡率增加,并可抑制局灶性脑缺血后大脑梗死区和海马区内源性NSCs增殖、迁移,并抑制NSCs向神经元的分化,其作用可能是Hcy通过降低甲基化转移酶的活性,同时导致甲基循环中的关键代谢物SAH浓度升高,SAM/SAH比值降低,抑制了甲基化反应的发生,使增殖迁移神经干细胞和分化神经元内5mC水平降低,进而抑制了NSCs的增殖和分化。