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硬骨鱼类虽然具有和高等脊椎动物相似的免疫系统,但作为低等脊椎动物,其特异性免疫机制尚不完善,非特异性免疫占据更为重要的地位。在非特异性免疫中,吞噬细胞在鱼类抗感染免疫中发挥核心作用。一些能与抗原结合并促进吞噬细胞吞噬功能的物质称为调理素;通过结合调理素辅助吞噬作用的现象称为调理化。目前,已经发现的调理素主要有补体活化成分C3b及IgG类抗体。新近,Li等人(2008;2009)的研究表明鱼类卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vg)也能发挥调理素的功能。然而,关于Vg参与调理作用的机理完全不了解。本论文主要目的就是研究Vg的调理作用类型与机理。
本论文首先利用Percoll密度梯度离心法从鲈鱼(Lateolabrax japonicus)头肾中分离纯化得到了巨噬细胞,并对其噬菌功能进行了鉴定。通过吞噬实验统计两个参数--吞噬能力(PA)和吞噬指数(PI)来评价巨噬细胞的噬菌水平,发现鲈鱼头肾巨噬细胞和酵母作用90min时吞噬能力可能达到最大值。然后,用鲈鱼头肾巨噬细胞吞噬与六线鱼(Hexagrammos otakii)Vg孵育过的酵母,结果发现,与对照相比,经Vg处理的实验组的PA和PI都有显著性提高(P＜0.05),说明Vg的调理素功能不具有种属特异性。利用六线鱼Vg可以促进鲈鱼头肾巨噬细胞吞噬作用这一系统,接着我们证明了Vg调理功能可被lavendustin(蛋白酪氨酸激酶PTK的特异性抑制剂)、PP1(蛋白酪氨酸激酶PTK的特异性抑制剂)和staurosporine(蛋白激酶C PKC抑制剂)所影响;但不受nocodazole(微管抑制剂)和C3 exoenzyme(Rho GTPases抑制剂)的影响,说明Vg的调理功能可能属于Ⅰ型机制。由于巨噬细胞Ⅰ型调理是由巨噬细胞膜表面受体FcγRs介导,激发吞噬信号传导通路。接下来,我们进一步验证FcγRs是否参与了Vg的调理。我们用异硫氰酸荧光素(FITC)标记的FcγRs三类受体的单克隆抗体FcγRⅠ、FcRⅡ和FcγRⅢ与鲈鱼巨噬细胞孵育,荧光显微镜观察发现这三种单克隆抗体均可以与巨噬细胞结合,表明巨噬细胞表面存在FcγRⅠ、FcγRⅡ和FcγRⅢ这三种受体。在此基础上,我们进而用这三种单抗对巨噬细胞表面相应受体进行封闭,检测受体封闭对Vg的调理功能的影响,结果发现,与对照相比,受体封闭能不同程度地抑制巨噬细胞吞噬vg孵育过的酵母,说明Vg可能通过与FcγRⅠ、FcγRⅡ和FcγRⅢ这三种受体结合介导调理过程。我们还对蛋白质酪氨酸激酶Sky和PI3-激酶是否参与Vg调理过程进行了研究。用蛋白质酪氨酸激酶Sky和PI3-激酶各自的特异性抑制剂piceatannol和wortmannin对鲈鱼巨噬细胞进行处理,通过realtime PCR的方法检测Vg调理后炎症因子TNF-α和IL-1β基因表达量的变化情况,结果发现,与对照相比,抑制剂处理组的TNF-α和IL-1β表达量有显著性下降(P＜0.05),说明蛋白质酪氨酸激酶Sky和PI3-激酶可能参与Vg调理过程的信号传导,影响炎症因子的产生。
总之,本文首次证明了鱼类’Vg诱导的吞噬作用属于Ⅰ型调理吞噬作用。经典的Ⅰ型调理吞噬作用主要由IgG抗体诱导,后来发现CRP诱导的吞噬作用也属于Ⅰ型调理吞噬作用。这说明Vg和CRP一样在诱导吞噬方面具有类抗体功能。