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目的:(1)类风湿性关节炎是一种常见的自身免疫性疾病。致残率高且预后差,对病人的身体造成很大影响,因此早期的诊断极为重要。近年来,抗环状瓜氨酸肽抗体被公认为诊断类风湿性关节炎新的血清指标物,目前临床上对这一指标物的检测采用化学发光法,此法受仪器干扰较大且检测耗时长,更重要的是检测试剂主要依赖进口,使患者和社会医疗成本增高,因此拥有我国自主研发的试剂具有很重要的意义。胶乳增强免疫比浊法具有灵敏度高、特异性高、线性范围宽,且能在普通生化分析仪上检测等优点,本课题根据胶乳增强免疫比浊法的原理,制备抗环瓜氨酸肽抗体免疫诊断试剂。(2)载脂蛋白E是血脂的检测指标物之一,想要获取纯的载脂蛋白E,必须有纯合子的供血者,而且无法得到结构和功能研究所需的人类非自然存在的突变体,所以重组载脂蛋白E非常必要,目前市场上已有的试剂所用载脂蛋白E抗原标准品主要依赖进口,获取难度大,本课题通过大肠杆菌发酵进行载脂蛋白E的表达,使用镍离子亲和层析法进行纯化,得到较纯的载脂蛋白E,并将其作为载脂蛋白E检测试剂的标准品。方法:(1)乳液聚合法制备羧化聚苯乙烯微球作为载体,偶联环状瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptide CCP)并进行表征成功后,制成具有免疫检测作用的诊断试剂,在生化分析仪上进行检测,通过考察其重复性,稳定性,线性范围,以及与发光法对比检测临床样本试验,来评价诊断试剂的各项性能。(2)构建含有载脂蛋白E目的基因的PET-28a质粒并导入到大肠杆菌中,通过大肠杆菌增殖表达载脂蛋白E,摸索温度和时间对表达的影响,最后确定载脂蛋白E表达的最优条件后进行载脂蛋白E的表达,并通过检测试剂盒对其进行免疫检测,以验证表达的载脂蛋白E的活性。结果:(1)通过调节SDS的量,成功制备各种不同粒径的羧基微球,考察CCP与羧基微球的偶联方法,选用层层修饰法,成功制备了抗环瓜氨酸肽抗体免疫诊断试剂的R2溶液,通过合成环瓜氨酸肽人工抗原,免疫山羊,经免疫测定,证明抗血清制备成功,稳定性实验和重复性实验表明制备的抗环状瓜氨酸肽抗体免疫诊断试剂盒线性范围宽,检测方便,稳定性好,证明该方法制备的试剂性能良好,且检测方便。对临床血清中的抗环状瓜氨酸肽抗体的检测表明该试剂盒具有很高的特异性和敏感性。(2)大肠杆菌表达载脂蛋白E通过考察诱导温度和时间来确定了最优条件后,采用最优诱导条件可大量表达载脂蛋白E,并对大肠杆菌表达的载脂蛋白E进行活性测定,结果显示大肠杆菌能成功表达具有活性的载脂蛋白E。结论:(1)以胶乳增强免疫比浊法为原理,制备的抗环状瓜氨酸肽抗体免疫诊断试剂盒线性范围宽,检测方便,稳定性好,具有高特异性和高敏感性,并可在普通生化分析仪上使用,在临床上可用于检测类风湿性关节炎患者体内的抗体,对类风湿性关节炎患者的早期诊断,预防和治疗具有很重要的临床指导意义。(2)大肠杆菌所表达的载脂蛋白E,活性较高,可作为载脂蛋白E诊断试剂盒的标准品。