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目的:子宫内膜异位症,简称为内异症,是育龄期女性的常见病,发生率约6%-10%,在不孕症或慢性盆腔痛女性中发生率则高达35%-50%。内异症虽然是良性妇科疾病,却具有类似恶性肿瘤的生物学行为,并且目前针对内异症的药物及手术治疗效果均不理想,复发率极高,严重影响女性的身心健康。因此,深入研究内异症发生发展的病理生理机制是提高疾病诊断及治疗方法的关键。关于内异症的发病机制存在多种假说,但其源头的分子机制尚未阐明。circRNA是一类特殊类型的非编码RNA,因其稳定的闭合环状结构,在不同物种中表现出的高度序列保守性,以及组织和时空表达特异性等特点而逐渐成为研究热点。circRNA生物学功能主要有以下几点:促进亲本基因的表达;参与调控翻译过程甚至调控可变剪接;直接翻译表达有效蛋白;而研究最成熟的是circRNA作为ceRNA,发挥miRNA分子“海绵”（miRNA sponge）作用调控下游靶基因的表达。越来越多的证据表明,circRNA作为miRNA分子“海绵”在肿瘤、心血管系统疾病、神经退行性病变等众多良恶性疾病中的发生发展和预后过程中发挥重要调控作用,某些特异性表达的circRNA还可以作为疾病诊断的新型标记物以及治疗的新靶点。内异症虽为妇科良性疾病,但具有恶性肿瘤的生物学行为,然而目前国内外有关circRNA与内异症的研究较少,内异症中circRNA的表达情况和潜在作用机制仍存在巨大空白。众所周知,卵巢是内异症最常见的发生部位,且卵巢型内异症往往影响育龄期女性的卵巢储备功能,导致不孕等。因此,本研究将卵巢型内异症作为研究侧重点,旨在采用高通量测序技术筛选出卵巢型内异症患者囊肿壁异位内膜组织和宫腔在位内膜组织中差异circRNAs的表达谱,结合生物信息学分析、qRT-PCR、功能实验等研究和探索调控内异症发生发展过程的关键circRNA,以期为内异症的病因学研究和分子靶向治疗提供新的切入点。研究方法:第一部分:利用高通量测序技术筛选6组配对的内异症ecEM和euEM组织中差异表达的circRNAs,基于差异表达的circRNA倍数变化、Padj值、readcount、序列长度等条件,筛选9个差异表达的circRNAs通过q RT-PCR法在扩大的组织样本中进行验证,获得在ecEM组织中异常高表达的circRNA,结合生物信息学分析,构建circRNA-miRNA-mRNA网络,进行靶基因功能富集分析。最终选择hsa＿circ＿0020093（命名为circATRNL1）,进行后续实验。第二部分:采用Ishikawa细胞系代替原代子宫内膜腺上皮细胞系进行细胞功能实验。FISH检测circATRNL1在Ishikawa细胞中的分布。构建circATRNL1过表达和干扰慢病毒载体转染至Ishikawa细胞改变细胞中circATRNL1的表达量,通过CCK8实验、细胞迁移实验和细胞侵袭实验检测不同circATRNL1表达水平下内膜上皮细胞的增殖、侵袭、转移等生物学行为的变化,另外通过Western blot法以及细胞免疫荧光实验检测不同circATRNL1表达水平下EMT蛋白标记物的变化。第三部分:通过生物信息学预测circATRNL1的mi RNA靶点,以及mi RNA下游靶mRNA。采用双荧光素酶实验验证circ ATRNL1与miR-141-3p/miR-200a-3p、miR-141-3p/miR-200a-3p与YAP1的靶向结合关系;通过qRT-PCR检测ecEM和euEM组织中mi R-141-3p/miR-200a-3p、YAP1表达量,并分析其与circATRNL1表达量的相关性。构建miRNA mimics及inhbitors、YAP1 siRNA,转染Ishikawa细胞,通过qRT-PCR检测circATRNL1表达水平对miR-141-3p/miR-200a-3p、YAP1的影响情况;通过CCK8实验、细胞迁移实验和细胞侵袭实验检测circATRNL1-miR-141-3p/miR-200a-3p-YAP1作用轴对细胞增殖、侵袭、转移等生物学行为的调控作用;通过Western blot检测circATRNL1-miR-141-3p/miR-200a-3p-YAP1作用轴对EMT蛋白标记物的影响情况。结果:第一部分:本研究首次采用高通量测序技术对6组内异症euEM组织和ecEM组织进行测序分析,筛选获得294个差异表达的circRNAs(∣log2FC≥1∣且Padj<0.05),其中146个表达上调,148个表达下调。通过qRT-PCR验证了hsa＿circ＿0003380,hsa＿circ＿0020093,hsa＿circ＿0008016以及hsa＿circ＿0077837在ecEM组织中显著高表达,差异具有统计学意义（P均<0.05）,与测序结果一致。对4个经验证的circRNAs构建ceRNA网络,共预测得到48个miRNAs和295个mRNAs,其中多个miRNA和mRNA曾被报道与内异症密切相关。进一步通过GO和KEGG功能富集分析发现,靶基因主要富集与各种代谢过程、细胞凋亡、细胞分化、蛋白酶活性等方面,同时也参与各类染色质、细胞膜、胞浆和细胞黏着斑的构成,主要参与的信号通路包括PI3K/AKT通路、癌症相关通路、MAPK通路、癌症中microRNAs通路、Ras通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药通路等。选择hsa＿circ＿0020093（circATRNL1）作为后续研究靶点。第二部分:FISH检测结果表明circATRNL1广泛存在于Ishikawa细胞中,且主要定位于细胞浆中。CCK8实验结果表明:转染circATRNL1过表达载体pHBLV-ATRNL1后Ishikawa细胞增殖率显著增高,而转染circATRNL1干扰载sh1-ATRNL1后细胞增殖率显著降低。细胞迁移实验结果显示:pHBLV-ATRNL1转染后细胞迁移能力增强,而sh1-ATRNL1转染后显著抑制细胞迁移。细胞侵袭实验结果表明:pHBLV-ATRNL1转染后细胞侵袭能力增强,而sh1-ATRNL1转染后显著抑制细胞侵袭。Western blot检测结果表明:pHBLV-ATRNL1转染组E-cadherin表达下调,ZEB1、N-cadherin、vimentin表达上调;与之相反,sh1-ATRNL1转染后细胞E-cadherin表达上调,而ZEB1、N-cadherin、vimentin表达下调。细胞免疫荧光结果显示:pHBLV-ATRNL1转染组E-cadherin荧光强度降低,表明E-cadherin表达下调,而N-cadherin荧光强度显著增强,表明N-cadherin表达上调;sh1-ATRNL1转染组结果相反。circATRNL1诱导Ishikawa细胞EMT表型发生,促进细胞增殖、迁移及侵袭行为。第三部分:双荧光素酶实验证实circATRNL1与miR-141-3p/miR-200a-3p、miR-141-3p/miR-200a-3p与YAP1之间的靶向结合,在组织中circATRNL1与miR-141-3p/miR-200a-3p的表达呈负性相关,而circATRNL1与YAP1呈正相关。CCK8实验、细胞迁移和侵袭实验结果表明:miR-141-3p/miR-200a-3p高表达后抑制细胞增殖、迁移和侵袭行为;Western blot结果表明:过表达miR-141-3p/miR-200a-3p后E-cadherin表达升高,而N-cadherin、Vimentin、ZEB1表达下降。Ishikawa细胞转染相应载体后,qRT-PCR结果表明,circATRNL1负向调控miR-141-3p/miR-200a-3p的表达,而间接正向调控YAP1表达。功能获得和功能缺失实验结果表明:上调miR-141-3p/miR-200a-3p表达或沉默YAP1表达均能够逆转circATRNL1过表达诱导的细胞增殖、迁移和侵袭行为,而敲减circATRNL1对细胞生物学行为的抑制效果在转染miR-141-3p及miR-200a-3p inhibitors后也获得逆转。Western blot检测结果:circATRNL1过表达后E-cadherin表达下调,ZEB1、N-cadherin、vimentin表达上调,共转染miR-141-3p mimics、miR-200a-3p mimics、YAP1-si#2后逆转了circATRNL1过表达对EMT蛋白标记物的影响;与之相反,敲减circATRNL1后E-cadherin表达上调,而ZEB1、N-cadherin、vimentin表达下调,共转染miR-141-3p inhibitors、miR-200a-3p inhibitors后同样逆转了其影响。结论:1.本研究首次采用高通量测序技术对卵巢型内异症euEM组织和ecEM组织进行分析,筛选获得294个差异表达的circRNAs(∣log2FC≥1∣且Padj<0.05),其中146个表达上调,148个表达下调。通过qRT-PCR验证了hsa＿circ＿0003380,hsa＿circ＿0020093,hsa＿circ＿0008016以及hsa＿circ＿0077837在ecEM组织中显著高表达,与测序结果一致。2.circATRNL1表达上调促进内膜上皮细胞源性的Ishikawa细胞增殖、迁移和侵袭,诱导EMT表型发生,而敲减circATRNL1则抑制上述生物学行为,逆转EMT。3.本研究证实了circATRNL1与mi R-141-3p/miR-200a-3p、miR-141-3p/miR-200a-3p与YAP1之间存在靶向结合关系。进一步qRT-PCR实验、细胞功能实验及Western blot检测结果表明,circATRNL1作为ceRNA,通过靶向结合miR-141-3p及miR-200a-3p,负向调控后者的表达,从而使miR-141-3p/miR-200a-3p共同下游靶基因YAP1高表达,促进细胞增殖、迁移、侵袭等生物学行为,诱导EMT。