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灵芝(Ganoderma lucidum)是我国的传统药用真菌,具有多方面生理活性和药理活性,但是,作为一种营养和保健价值极高的大型担子菌,灵芝的分子生物学研究还比较少。灵芝三萜类化合物,属于灵芝的次级代谢产物,被认为是灵芝的主要有效成分之一。现阶段对于灵芝三萜生物合成的研究主要集中在通过改变发酵参数和添加诱导物提高灵芝三萜的产量,并通过克隆获得灵芝三萜生物合成途径中关键酶基因以研究灵芝三萜的合成机理。但是对于灵芝三萜生物合成基因表达的组织和发育的调控机制方面的研究还比较少,主要原因是转基因方法等基因工程学手段的缺乏。本文在灵芝中首次建立了根癌农杆菌介导的灵芝遗传转化体系,并在这一体系的基础上建立了灵芝报告基因表达系统及其检测体系。首先通过根癌农杆菌LBA4404菌株和灵芝原生质体细胞的共培养以及潮霉素B的抗性筛选,获得了一批具有潮霉素抗性的灵芝转化子菌株,并通过PCR扩增潮霉素基因(hph)片段和Southern Blot试验证实外源基因片段hph基因片段已成功整合进灵芝转化子的基因组中。然后通过对各共培养参数的调整以进一步优化这一转化方法。我们在农杆菌与原生质体比例为1000：1,添加0.2mM乙酰丁香酮,于25℃共培养36小时的条件下,我们获得了200个转化子/105原生质体,这一转化效率显著高于前期研究中电激法和REMI法的转化效率。另外,本研究通过应用灵芝的glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(gpd)基因启动子、香菇的gpd基因启动子、香菇的ras基因启动子和构巢曲霉的gpd基因启动子带动抗性标记基因,从而比较不同来源启动子对转化效率的影响,结果显示以灵芝gpd基因带动抗性标记基因的表达载体获得了最高的转化效率,而应用香菇gpd和ras基因启动子的表达载体的转化效率相近,并高于构巢曲霉的gpd基因启动子带动抗性标记基因的表达载体。这一结果证明内源启动子能够显著提高转化效率。同时,本研究通过比较EGFP和GUS这两个在植物中常用的报告基因在灵芝中的表达情况,发现EGFP蛋白在灵芝中的表达比较弱,而GUS在灵芝中的表达效率要高于EGFP,并以GUS为报告基因建立了灵芝报告基因表达系统。为研究灵芝三萜生物合成途径中的关键酶甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因(mvd)的功能和它在灵芝三萜代谢网络中的作用,本研究对该基因进行了过表达研究。我们构建了Gl-mvd过表达载体,并通过应用根癌农杆菌介导的灵芝转化方法,将Gl-mvd过表达载体转入灵芝中。随机挑取4株获得的过表达转化子GMOEs,进行Real-time PCR分析以考察Gl-mvd基因在mRNA水平的表达量。结果表明,GMOE9中Gl-mvd基因的表达量约为野生型菌株G20的4.5倍；其余三株GMOEs中Gl-mvd基因的表达量也均在野生型菌株G20的2.5-4.5倍。将上述挑取的GMOEs,进行的Western Blot分析以考察Gl-mvd基因在蛋白质水平的表达量。结果表明,这四株GMOEs中Gl-mvd基因的蛋白质表达量相比于野生型菌株G20并无明显提高。为深入了解Gl-mvd的过表达对表型性状的影响,我们进一步考察了上述转化子三萜含量的变化,结果表明,GMOE10与出发菌株G20相比,其三萜含量提高101%。其他三株过表达转化子与G20相比,其三萜含量均有明显的提高。对其生物量变化进行测定显示Gl-mvd的过表达与灵芝生物量变化并无直接关系。为了探讨GMOEs中三萜含量增加的机理,我们进一步考察了参与三萜合成的其它关键酶基因在GMOEs中mRNA水平的表达量。发现随着Gl-mvd基因的过表达,所考察的Gl-hmgs、Gl-hmgr、Gl-fps、Gl-sqs和Gl-osc基因的转录水平的表达量均有不同程度的增加。瞬时转染技术在启动子等调控元件研究中已经得到广泛的应用。本研究首次将瞬时转染技术应用于灵芝基因启动子分析,对实验室前期获得的灵芝三萜生物合成途径中的关键酶灵芝鲨烯合酶基因的启动子进行了分析。根据前期研究得到的Gl-sqs启动子序列,构建Gl-sqs启动子系列缺失载体。将5’缺失系列载体通过根癌农杆菌介导的灵芝转化体系转入灵芝中,并通过测定GUS酶活性对这些5’缺失启动子进行活性分析。其分析结果与生物信息学分析结果是比较吻合的,尤其是预测的CAAT-box等顺式作用元件的缺失对启动子活性具有明显下调的影响。但是,其中在对-868到-673区域进行缺失后,发现启动子活性呈现上升现象,然而在对该区域进行生物信息学分析时并未预测出该区域存在抑制启动子活性的顺式作用元件。对该区域进行进一步的50bp缺失分析显示,对-822到-776和-775到-721两个区域的缺失,则使启动子活性大幅度上升,表明该区域存在有能够显著降低启动子活性的结构。另外,在实验室的前期研究中我们已经发现MeJA对灵芝三萜生物合成具有显著的诱导作用,同时能够显著提高sqs基因的表达水平。在对灵芝sqs基因启动子的生物信息学分析时,我们发现在灵芝sqs基因启动子上存在有3个潜在的MeJA响应元件作用位点。通过应用瞬时转染技术,我们对这三个潜在的MeJA响应元件进行了缺失和突变分析。结果显示位于启动子上不同位置的3个潜在的MeJA响应元件的关键位点均具有响应MeJA诱导Gl-sqs基因表达的能力。这一结果为深入研究MeJA对灵芝三萜生物合成调控作用奠定基础,进一步完善了人们对灵芝三萜生物合成调控的认识。