植物体内重金属富集相关代谢产物分析方法的建立及其应用

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重金属污染日益严重的今天,植物修复在技术和经济上具有双重优势:1)可运用于土壤、水体等,范围广泛;2)原位清除污染物,保护土壤结构,无二次污染;3)修复过程可增加土壤肥力;4)以传统农业措施种植植物,成本减少;5)可从富含重金属的植物中提取重金属,取得直接经济效益;6)修复的同时美化环境。因此,该技术成为极具潜力的重金属污染修复技术。目前,重金属的植物修复仍存在着如何提高修复效率和速率的主要问题,为了更好的发展植物修复技术,迫切需要进行超富集植物重金属富集机理的研究。目前,富集机理尚未清楚,对超富集植物重金属富集机理的研究成为国际上环境科学领域的难点和热点研究课题。 重金属污染土壤对于植物来说属于极端环境,植物对极端环境的适应可以发生在形态结构上,也可以发生在生理生化上,而一些代谢产物则成为后一种适应的物质基础。因此,研究超富集植物代谢产物对揭示富集机理具有重要意义。 宝山堇菜为本实验室发现的多种重金属超富集/富集植物,对Zn、Cd、Pb 具有超富集/富集特性。本研究针对植物体内可能参与重金属富集、转运、解毒相关的代谢产物,建立相应的灵敏、精确及准确的分析方法,并应用于重金属胁迫下宝山堇菜与紫花地丁(对照植物)体内代谢产物的分析研究,主要包括三类物质的分析方法:有机酸类、植物激素类及氨基酸。 研究报告分为四个部分: 前言部分基于重金属污染以及植物修复技术的现状,阐述了重金属超富集植物富集机理研究的重要性,同时阐明研究超富集植物体内代谢产物对揭示富集机理的重要性;提出选择代谢产物中有机酸类、植物激素类及氨基酸作为本研究目标代谢产物的依据;指出了建立相应分析方法的必要性。 第一章优化了有机酸离子排斥色谱分析方法中的各项参数,建立了灵敏、准确、快速以及同时检测多个有机酸的分析方法,并将其应用于超富集植物宝山堇菜及其对照植物紫花地丁的分析当中。在方法优化过程当中,本研究揭示了各有机酸在不同流动相酸度条件下色谱洗脱行为满足以下规律:有机酸容量因子与流动相酸度间满足指数相关函数关系,但不同有机酸的指数相关函数不同。同时发现有机酸疏水性及酸性与色谱行为存在一定规律,并对该规律进行了数学拟合,揭示有机酸保留时间与疏水性参数LogP和酸性参数pKa的加和值呈指数增长函数关系。在所建立的分析方法基础上,对宝山堇菜和紫花地丁体内的有机酸进行了测定,检测到六种已知有机酸(草酸、柠檬酸、苹果酸、喹宁酸、琥珀酸和富马酸),同时检测到六种未知有机酸,通过有机酸保留时间与pKa和LogP加和值指数增长函数关系的计算,推断其中三个可能为水杨酸、乙醇酸、乙醛酸。本研究进一步对不同浓度Cd处理下宝山堇菜和紫花地丁体内有机酸进行了测定,并对各有机酸含量与Cd处理浓度的相关性进行了研究,发现以下规律:1)72小时不同Cd浓度处理下,紫花地丁地上部分各个有机酸与Cd浓度均未显示出明显的相关性,而宝山堇菜地上部分中的柠檬酸和苹果酸却与Cd处理浓度(体内Cd含量)呈正相关性,其余四种有机酸未显示与Cd处理浓度(体内Cd含量)相关性;2)72小时不同Cd浓度处理下,紫花地丁下部分各个有机酸与Cd浓度均未显示出明显的相关性;宝山堇菜地下部分中的琥珀酸与Cd处理浓度(体内Cd含量)呈弱的正相关性,其余五种有机酸未显示与Cd处理浓度(体内Cd含量)相关性;3)对于六种未知有机酸谱峰来说,未知谱峰#6(可能为水杨酸)值得关注。虽然该谱峰归一化积分面积与Cd处理浓度未显示出明显相关性,但在宝山堇菜地上部分和地下部分的响应中,Cd处理后的归一化积分面积均远远高于空白样品(未加Cd处理),而这一现象未在紫花地丁中发现。因此,推断该谱峰可能与富集机理相关,应对其进行进一步的研究。 第二章建立了植物激素一种准确、灵敏的分析方法,并成功应用于液态样品(香蕉木质部流出液)和固体样品(宝山堇菜)中植物激素的分析当中。该方法采用固相微萃取作为样品前处理手段,并将其与液相色谱联用,对影响固相微萃取的各项因素进行了优化,最终优化条件为:PA萃取纤维萃取、溶液pH值为3.0、溶液盐度为300 g·L<-1>、萃取时间为90分钟、萃取温度为室温。对所建立的固相微萃取-液相色谱/紫外吸收联用法进行了评价,发现:1) 该方法较传统固相萃取-液相色谱/紫外吸收法灵敏度提高2到3个数量级;2)在适当的稀释条件下,该方法成功的应用于香蕉木质部流出液当中植物激素的分析,证明该方法可以直接应用于液体样品,优于现有分析方法:3)该方法还成功的应用于宝山堇菜体内植物激素的分析,方法准确度和精密度高,更适合于生物量小的植物样品,为研究宝山堇菜富集机理提供了良好的分析手段。 第三章建立了氨基酸柱前衍生化的高效液相色谱分析方法,通过选择Dabsyl Chloride作为衍生化试剂,在氨基酸原有氨基基团上加入可见生色基团,使得衍生化产物具有可见强吸收特性,提高了分析灵敏度。通过对柱温的优化、流动相pH值的优化以及衍生化反应时间的优化,实现了16种氨基酸的良好分离。
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