论文部分内容阅读
木本植物的生长发育尤其是次生生长与木材的产量密切相关,然而,目前相关的调控机制研究尚处于初步阶段。KNOTTED1-like homeobox genes（KNOX）是具有同源异型结构域的转录调控因子,依据结构与功能的差异,分为I类KNOX和II类KNOX。拟南芥中I类KNOX包含四个成员,分别是SHOOTMERISTEMLESS（STM）、BREVIPEDICELLUS（BP）、KNOTTED-like in Arabidopsis 2（KNAT2）以及KNAT6。目前的研究发现,拟南芥I类KNOX基因在植物顶端分生组织、叶片、茎及根等生长发育过程中发挥重要作用。杨树中初步分析了STM与BP同源基因ARK1与ARK2生物学功能,发现其均参与形成层分化及木质素合成的调控,而杨树中KNAT2与KNAT6同源基因的功能尚不清楚。本研究以杨树中KNAT2与KNAT6的同源基因为研究对象,重点考察木本植物生长发育尤其是次生生长中I类KNOX的作用机制,为木材形成过程中相关调控网络的构建提供重要线索,同时为林木遗传育种提供重要的理论依据。本研究以银腺杨（Populus alba×P.glandulosa,84K杨）中I类KNOX基因KNAT2与KNAT6同源基因PagKNAT2/6b为研究对象,主要研究结果如下:1.通过BLAST分析发现杨树中包含10个I类KNOX基因。随后,根据基因结构与进化关系将10个I类KNOX基因分为3组。其中组1成员与拟南芥KNAT2、KNAT6有较高的相似性;组2成员与拟南芥STM、BP相似性较高;组3成员则为杨树特有。不同组别的I类KNOX基因在不定芽与不定根发生过程中表达量变化有所不同,组1基因在芽原基分化产生不定芽的关键期上调表达,在根原基分化产生不定根的过渡期上调表达;组2与组3成员在分生组织分裂分化产生芽原基的过程中高表达,在不定根发生至后期不定根形态建成阶段高表达。2.氨基酸序列相似性分析发现Ptr KNAT2/6b与拟南芥KNAT2与KNAT6相似性最高,且组织表达模式分析表明,Ptr KNAT2/6b在杨树茎中的表达量显著高于其他三个KNAT2/6成员。烟草叶片瞬时表达分析发现PagKNAT2/6b蛋白定位于细胞核,证实了PagKNAT2/6b转录因子的身份。本研究创制了PagKNAT2/6b过表达（PagKNAT2/6b-OE）转基因杨树,表型观察发现,PagKNAT2/6b-OE杨树表现出矮小、纤细、节间短、叶片小且不对称、叶柄短或无、分枝增多等表型,提示PagKNAT2/6b异常表达影响杨树茎的径向生长、高生长及分枝发育等过程。3.对PagKNAT2/6b-OE杨树不同节间的横切片观察发现,PagKNAT2/6b-OE木质部分化受到抑制。同时,木材化学成分测定与细胞壁厚度统计分析显示PagKNAT2/6b-OE杨树中纤维素、木糖以及木质素沉积减少且纤维细胞的厚度显著降低,表明PagKNAT2/6b负调控次生壁的形成。随后,通过解剖分析、RNA-seq与Ch IP-seq数据分析、转录调控实验及凝胶阻滞实验（EMSA）验证等方法解析PagKNAT2/6b在杨树茎的径向生长中的调控机制。研究结果表明,PagKNAT2/6b直接激活XND1a的表达,通过NAC-MYB-次生壁合成相关基因的调控途径,影响杨树木质部分化与次生壁形成。4.对PagKNAT2/6b-OE杨树不同节间长度统计结果分析发现,PagKNAT2/6b-OE杨树节间较对照短,进一步的细胞学分析表明,PagKNAT2/6b-OE杨树茎的表皮细胞、髓心细胞、纤维细胞与导管细胞长度均小于对照,提示PagKNAT2/6b通过抑制细胞的伸长抑制节间的伸长。本研究通过赤霉素（GAs）含量测定、GA3激素处理、q RT-PCR分析、Ch IP-PCR实验分析PagKNAT2/6b在杨树高生长中的调控机制。研究结果表明,杨树中I类KNOX基因PagKNAT2/6b直接抑制GA20ox1的表达,影响植株茎中GAs含量,从而调控茎部节间的伸长。5.对PagKNAT2/6b-OE杨树出现分枝数目异常增多的表型,鉴于独角金内酯（SL）在分枝调控中的重要作用,PagKNAT2/6b-OE杨树表型与SL缺陷型植株的表型相似。为此,本研究检测了PagKNAT2/6b-OE杨树中SL的含量,发现其含量较对照显著降低。随后,通过q RT-PCR分析了杨树中SL合成基因的表达,发现PagKNAT2/6b-OE中SL合成基因的表达量显著下降。进一步的转录激活实验证实了PagKNAT2/6b可以调控SL合成基因Ptr MAX3、Ptr MAX4a、Ptr MAX4b、Ptr LBO的表达。以上实验结果表明PagKNAT2/6b通过抑制SLs合成基因表达,从而实现对杨树分枝性状的调控。综上所述,本研究详细考察了杨树PagKNAT2/6b基因在杨树生长发育尤其是次生生长过程中的作用机制,揭示了PagKNAT2/6b对木质部分化与细胞壁合成、节间伸长、分枝发育等方面的生物学功能,为木本植物发育尤其是木材形成相关调控网络的构建提供了重要线索,同时为林木遗传育种提供了理论参考。