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需盐色盐杆菌DSM3043是一株已经获得全基因组测序的中度嗜盐菌，具有宽广的耐盐范围，可以在0.5M-4M的盐浓度环境下进行正常的生理代谢功能，甘氨酸甜菜碱可以在缺乏营养物质的环境中充当胞内的碳氮源来维持细胞正常的生理代谢功能，需盐色盐杆菌DSM3043菌株耐盐范围非常广,可在0.5M-4M的NaCl浓度下生长,是理想的耐盐模式菌株。实验室前期通过建立了需盐色盐杆菌DSM3043的基因敲除系统，对需盐色盐杆菌DSM3043基因序列中的csal_0990，csal_1004，csal_1005进行了基因有痕敲除。并且通过对csal_1004，csal_1005基因进行大肠杆菌异源表达分析其酶学反应产物认定两个基因共同参与到甜菜碱脱甲基降解成二甲基甘氨酸的第一步过程中。
本实验从三方面对需盐色盐杆菌DSM3043菌株中二甲基甘氨酸脱甲基到肌氨酸的降解过程进行研究：
1.我们通过生物信息学分析发现编码甘氨酸甜菜碱降解为二甲基甘氨酸过程中的两个基因Csal_1004和Csal_1005位于一个基因簇中。这些基因的编码产物可能参与甘氨酸甜菜碱及其中间代谢产物(甲醛、甲酸)的降解代谢过程中。其中Csal_0990可能编码一个氧化还原酶，基因Csal_0991、Csal_0992可能分别编码铁氧化还原蛋白、电子传递蛋白α亚基和电子传递蛋白β亚基。我们构建了?Csal_0990、?Csal_0991、?Csal_0992和?Csal_0993四个基因无痕缺失突变株来对其进行生理学实验分析，通过突变株与野生型ZW4-1菌株在以硫酸铵为唯一氮源，甘氨酸甜菜碱，葡萄糖分别为唯一碳源的限定性培养基上的生长情况认定基因簇中Csal_0990-0993四个基因都参与到需盐色盐杆菌DSM3043中二甲基甘氨酸的降解过程。
2.对?Csal_0990-0993四株无痕敲除敲除突变株在以葡萄糖为碳源，甘氨酸甜菜碱，二甲基甘氨酸，肌氨酸，甘氨酸分别为唯一氮源的限定性培养基上进行培养，通过观察其生长情况确定了Csal_0990、Csal_0991、Csal_0992、Csal_0993四个基因参与到二甲基甘氨酸降解到肌氨酸过程中。通过离子色谱对阳离子和氨基酸的浓度检测来反映野生型3043代谢二甲基甘氨酸后的代谢产物与周围环境的相互作用。
3.我们为了验证生物信息学分析的结果csal_0990基因为二甲基甘氨酸降解到肌氨酸的关键基因的推测)，以及构建了csal_0990基因表达载体，对其诱导过程中诱导终浓度和诱导温度进行优化后，根据SDS-PAGE结果我们采用N-His的csal_0990基因表达载体进行接下来的酶学性质和酶反应产物验证的试验。我们通过对csal_0990基因表达的纯酶对其酶学性质进行了解析(1)csal_0990基因表达纯酶为黄素蛋白，蛋白大小为72.6Kda，Native-page结果中显示该酶所在位置有颜色反应，说明该酶具有酶活。(2)csal_0990基因表达的纯酶为黄素蛋白，利用热变性法提取非共价结合，使用C18柱进行HPLC检测。(3)csal_0990基因表达的纯酶在底物存在下的紫外-可见光全波长扫描下可以与底物二甲基苷酸混合后峰形整体开始降低，说明DMGDH具有酶活力其具有底物特异性。(4)我们通过高效液相HPLC的方法对PMS+NBT酶反应产物进行测定，测定产物为肌氨酸，所以确定csal_0990基因所表达的蛋白为DSM3043中二甲基甘氨酸脱甲基到肌氨酸过程中的关键蛋白，所以我们将csal_0990基因表达的产物称为DMGDH蛋白。
本实验从三方面对需盐色盐杆菌DSM3043菌株中二甲基甘氨酸脱甲基到肌氨酸的降解过程进行研究：
1.我们通过生物信息学分析发现编码甘氨酸甜菜碱降解为二甲基甘氨酸过程中的两个基因Csal_1004和Csal_1005位于一个基因簇中。这些基因的编码产物可能参与甘氨酸甜菜碱及其中间代谢产物(甲醛、甲酸)的降解代谢过程中。其中Csal_0990可能编码一个氧化还原酶，基因Csal_0991、Csal_0992可能分别编码铁氧化还原蛋白、电子传递蛋白α亚基和电子传递蛋白β亚基。我们构建了?Csal_0990、?Csal_0991、?Csal_0992和?Csal_0993四个基因无痕缺失突变株来对其进行生理学实验分析，通过突变株与野生型ZW4-1菌株在以硫酸铵为唯一氮源，甘氨酸甜菜碱，葡萄糖分别为唯一碳源的限定性培养基上的生长情况认定基因簇中Csal_0990-0993四个基因都参与到需盐色盐杆菌DSM3043中二甲基甘氨酸的降解过程。
2.对?Csal_0990-0993四株无痕敲除敲除突变株在以葡萄糖为碳源，甘氨酸甜菜碱，二甲基甘氨酸，肌氨酸，甘氨酸分别为唯一氮源的限定性培养基上进行培养，通过观察其生长情况确定了Csal_0990、Csal_0991、Csal_0992、Csal_0993四个基因参与到二甲基甘氨酸降解到肌氨酸过程中。通过离子色谱对阳离子和氨基酸的浓度检测来反映野生型3043代谢二甲基甘氨酸后的代谢产物与周围环境的相互作用。
3.我们为了验证生物信息学分析的结果csal_0990基因为二甲基甘氨酸降解到肌氨酸的关键基因的推测)，以及构建了csal_0990基因表达载体，对其诱导过程中诱导终浓度和诱导温度进行优化后，根据SDS-PAGE结果我们采用N-His的csal_0990基因表达载体进行接下来的酶学性质和酶反应产物验证的试验。我们通过对csal_0990基因表达的纯酶对其酶学性质进行了解析(1)csal_0990基因表达纯酶为黄素蛋白，蛋白大小为72.6Kda，Native-page结果中显示该酶所在位置有颜色反应，说明该酶具有酶活。(2)csal_0990基因表达的纯酶为黄素蛋白，利用热变性法提取非共价结合，使用C18柱进行HPLC检测。(3)csal_0990基因表达的纯酶在底物存在下的紫外-可见光全波长扫描下可以与底物二甲基苷酸混合后峰形整体开始降低，说明DMGDH具有酶活力其具有底物特异性。(4)我们通过高效液相HPLC的方法对PMS+NBT酶反应产物进行测定，测定产物为肌氨酸，所以确定csal_0990基因所表达的蛋白为DSM3043中二甲基甘氨酸脱甲基到肌氨酸过程中的关键蛋白，所以我们将csal_0990基因表达的产物称为DMGDH蛋白。