论文部分内容阅读
胰腺癌一种死亡率极高的恶性消化系统肿瘤,接近60%的胰腺癌患者的死因与肝转移癌有关,目前针对胰腺癌的手术及放化疗等治疗方法效果均不理想,因此寻求一种可以有效治疗胰腺癌并抑制其转移的方法是目前胰腺癌相关研究的重点。大量研究已明确有多种miRNA与肿瘤发生发展密切相关,其中miRNA-1271是一种具有肿瘤抑制效应,参与抑制肿瘤上皮-间充质细胞转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)、诱导肿瘤细胞凋亡的miRNA,但是其对胰腺癌细胞的影响及调控作用的相关研究还很少。祖国传统医学是胰腺癌综合治疗方法的重要组成部份,大黄素是众多抗癌中草药中的有效活性成分,研究表明大黄素对包括胰腺癌在内的多种恶性肿瘤具有治疗作用,并具有通过调节miRNA抗肿瘤的功效,但是关于大黄素抑制胰腺癌转移侵袭的机制研究目前未见大量报道。本实验课题从mi RNA对胰腺癌EMT的调控机制入手,研究miRNA-1271和大黄素对胰腺癌细胞侵袭转移的抑制作用,实验分为三部分。实验第一部分目的:验证miRNA-1271对胰腺癌细胞EMT的影响作用。方法:分别将miRNA-1271模拟物,miRNA-1271抑制物,及阴性对照物转染至胰腺癌细胞,并设立对照组。使用western-blot实验方法检测胰腺癌细胞EMT相关标志物E-cadherin、ZEB1、TWIST1的蛋白含量变化,RT-PCR实验检测各实验组胰腺癌细胞内miRNA-1271、E-cadherin、ZEB1、TWIST1的mRNA水平,Transwell小室模型检测各实验组的胰腺癌细胞侵袭能力的改变。结果:转染mi RNA-1271模拟物组与其他实验组比较,miRNA-1271和E-cadherin的mRNA表达水平升高(P<0.05),各实验组ZEB1,TWIST1的m RNA水平无明显差异(P>0.05)。miRNA-1271模拟物组同其他实验组相比E-cadherin蛋白表达水平升高,ZEB1,TWIST1蛋白表达水平降低(P<0.05)。miRNA-1271抑制物组胰腺癌细胞的E-cadherin蛋白水平最低,而ZEB1,TWIST1的蛋白表达水平较其他组明显升高(P<0.05)。Transwell小室模型实验miRNA-1271模拟物组胰腺癌细胞侵袭能力较其他各组明显下降(P<0.05)。结论:结果表明miRNA-1271可以明显抑制胰腺癌细胞的EMT过程。而RT-PCR检测各实验组ZEB1,TWIST1的mRNA水平无明显差异,提示miRNA-1271可能作用于ZEB1,TWIST1基因的转录后阶段并不降解靶基因的mRNA。实验第二部分目的:使用不同浓度大黄素处理胰腺癌细胞,观察胰腺癌细胞内miRNA-1271水平及EMT标志分子的变化。方法:分别使用高、低浓度大黄素处理胰腺癌细胞,并设立对照组。使用western-blot实验检测各胰腺癌细胞EMT标志物E-cadherin、ZEB1、TWIST1的蛋白含量变化,RT-PCR实验检测各实验组胰腺癌细胞内miRNA-1271、E-cadherin、ZEB1、TWIST1的mRNA水平,Transwell小室模型检测各实验组的胰腺癌细胞侵袭能力的改变。结果:高低剂量大黄素组与对照组相比,胰腺癌细胞内miRNA-1271和E-cadherin的mRNA表达水平升高(P<0.05),各实验组ZEB1,TWIST1的mRNA水平无明显差异(P>0.05)。大黄素组同对照组相比E-cadherin蛋白表达水平升高(P<0.05),ZEB1,TWIST1蛋白表达水平降低(P<0.05)。Transwell小室模型实验证明大黄素组胰腺癌细胞侵袭能力较对照组明显下降(P<0.05),而高浓度大黄素组较低浓度大黄素组对胰腺癌细胞的EMT抑制作用更加显著(P<0.05)。结论:实验结果证明大黄素通过提高胰腺癌细胞内miRNA-1271的水平进而实现对胰腺癌细胞EMT的抑制作用。实验第三部分目的:建立裸鼠脾脏注射胰腺癌细胞致肝转移的动物模型,验证大黄素在动物体内实验中对胰腺癌肝转移的抑制作用。方法:使用45只裸鼠进行脾脏注射胰腺癌细胞建立胰腺癌肝转移动物模型,实验分为3组,高剂量大黄素组(大黄素灌胃,50mg/Kg体重/天),低剂量大黄素组(大黄素灌胃,20mg/Kg体重/天),对照组(2ml生理盐水灌胃),每组各15只。6周后处死裸鼠,观察裸鼠胰腺癌肝转移情况,计算各组裸鼠肝转移癌的肿瘤结节数量,转移灶增殖抑制率,肝转移抑制率。使用RT-PCR实验检测各实验组胰腺癌肝转移癌组织内miRNA-1271、E-cadherin、ZEB1、TWIST1的mRNA水平,使用Western-blot及免疫组化实验检测胰腺癌肝转移肿瘤组织中E-cadherin、ZEB1和Twist1蛋白表达水平。结果:高、低剂量大黄素组裸鼠的肝转移瘤结节数量,转移灶增殖抑制率,肝转移抑制率等指标均要优于对照组(P<0.05),低剂量大黄素组裸鼠肝转移的治疗效果要稍差于高剂量大黄素组。该结果提示大黄素对于胰腺癌肝脏转移有一定的抑制作用,且抑制效果随着大黄素剂量的增加而提高。高低剂量大黄素组与对照组相比,胰腺癌组织内miRNA-1271和E-cadherin的mRNA含量水平显著升高(P<0.05)。Western-blot实验及免疫组化实验结果显示大黄素组同对照组相比,胰腺癌肝转移肿瘤组织中E-cadherin蛋白含量明显升高,ZEB1和Twist1蛋白表达水平明显下降(P<0.05)。结论:裸鼠动物体内实验验证了大黄素通过提高胰腺癌内miRNA-1271的含量抑制胰腺癌细胞的EMT过程,进而发挥对胰腺癌肝转移的治疗及预防作用。