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黄原胶(xanthan gum,XG)是由野油菜黄单胞杆菌(Xanthomonas campestris)以糖类为主要原料经发酵生产的一种水溶性多糖,相对分子质量(relative molecular mass, Mr)为2×106-2×107。XG溶液具有较好的黏弹性,关节腔注射可起到润滑和缓冲应力的作用。本实验室前期研究表明,XG对于实验性骨关节炎(osteoarthritis, OA)具有较好的治疗效果。关节腔注射XG可保护关节软骨,减轻OA症状,延缓实验性OA进程。临床常用透明质酸(hyaluronic acid,HA)注射液治疗OA,但HA容易被体内的酶和自由基降解,作用时间较短,短期内需频繁注射。XG与HA同属生物大分子多糖,具有相似的黏弹性,但XG性质稳定,不易被体内的酶和自由基降解,5周给药2次XG用于实验性OA的疗效与5周给药5次HA的疗效并无显著性差异。关节腔注射XG在关节腔内的存留时间可能更长,从而能减少注射次数,减少关节腔注射引起的损伤,增加患者的顺应性。为评价XG的疗效及安全性,应进行XG注射液体内药代动力学研究。本研究通过发酵法制备14C放射性标记XG,研究XG在动物关节腔局部的消除规律,初步阐明XG在体内的吸收、分布及排泄特征,为XG注射液的开发提供一定的理论依据,也为XG在其他领域的研究应用提供数据支持。1发酵制备14C标记黄原胶目的：14C放射性标记XG,制备放化纯度及比活度可用于动物体内药动学实验的14C标记XG (14C-XG)样品。方法：在发酵培养基中利用14C标记葡萄糖(14C-葡萄糖)与普通葡萄糖作混合碳源,经发酵用14C放射性标记XG。通过控制总碳源加入量控制产胶量,使培养基中添加14C-葡萄糖的放射性强度一定时,所得被标记的XG样品具备一定的比活度。考察了14C-葡萄糖加入量对产胶量及其利用率的影响。在15 mL发酵液中加入1200 μCi的14C-葡萄糖,发酵并对所得样品进行精制纯化,制备了14C-XG。结果：数据显示在碳源浓度0.5%-2%范围内,产胶量与总碳源葡萄糖加入量成线性关系,加入的14C-葡萄糖在XG粗品的比率约为60%,其加入量对产胶量并无显著影响。最终采用碳源葡萄糖的总量为0.7%,其中14C-葡萄糖的加入量占总碳源0.71%,发酵制备了14C-XG。对发酵所得14C-XG进行纯化精制,制得了比活度为7.27 μCi/mg,放化纯度为99.5%的14C-XG精品,用于动物体内药动学实验研究。结论：采用14C-葡萄糖与普通葡萄糖作混合碳源,可成功发酵制备14C-XG,工艺稳定,可重复性强。纯化所得14C-XG样品,其放化纯度及比活度可用于后续动物体内药动学实验。2黄原胶在关节腔内的消除目的：考察关节腔注射XG在动物关节腔内的消除规律。方法：家兔关节腔分别单次注射1%(w/v)的5-氨基硫脲荧光素标记XG与14C-XG,剂量为0.1mL/kg,比较研究了荧光标记与放射性标记XG从家兔关节腔内的消除规律。大鼠单次关节腔注射14C-XG(0.25、0.5、1 mg,即浓度0.5%、1%、2%的14C-XG各50μL)后,于不同时间点处死动物,测定关节腔内放射性残留,研究XG在大鼠关节腔内消除的动力学特征。采用14C-XG研究XG在家兔关节局部组织的分布。结果：荧光标记与放射性标记XG均可从关节腔内消除。同一时间点,荧光标记法测得关节腔内XG残留量小于放射性标记法测定值。各时间点所获得14C-XG在关节滑液的残留量,均高于文献报道同法操作所测得14C标记HA在家兔关节滑液内的残留量。关节腔注射XG 1 mg,在大鼠膝关节内的平均滞留时间(mean residence time,MRT)约为333 h,给药后30d仍有约27%的残留量,180 d后仍有9.85%的残留。AUC与给药剂量成正相关,相关系数为0.9999,且同一时间点、不同给药剂量XG在关节腔内的残留比例差异并不明显,说明XG在关节腔内随时间消除的比例并无明显剂量依赖性。结论：XG可在动物关节腔内消除。XG在关节腔内消除较慢,MRT超过HA,可延长给药时间继续研究其药效。家兔关节腔注射14C-XG后,主要分布在关节滑液,少量可进入关节软骨、滑膜、半月板、关节内脂肪及肌肉组织或结合在其表面。3黄原胶在大鼠体内的药动学目的：考察了关节腔注射XG在大鼠体内的吸收、组织分布和排泄规律。方法：大鼠单次关节腔注射14C-XG后(0.25、0.5、1 mg,即0.5%、1%、2%各50μL),测定不同时间点血浆内的药物浓度。对低、中、高剂量的血药浓度-时间数据采用非房室模型法计算药动学参数,将AUC和Cmax与给药剂量进行相关性分析。设置腹腔注射对照组进行对比研究。对单次关节腔注射14C-XG 1 mg的实验动物,进行不同时间点主要组织药物残留测定。收集粪、尿及呼吸排出的CO2,测定排泄物中放射性。结果：大鼠关节腔注射14C-XG后,可在血浆、主要组织器官及排泄物中检测到放射性。AUC及Cmax与给药剂量成正相关,而消除半衰期t1,2、MRT、达峰时间Tmax与剂量并无显著依赖性,提示关节腔注射XG后在大鼠血浆中的吸收消除情况呈线性动力学。与腹腔注射相比,关节腔注射XG达峰时间迟缓,较腹腔注射吸收慢,关节腔注射XG的相对生物利用度为41.7%,较腹腔注射吸收量少。关节腔注射14C-XG后,在大鼠各主要组织中均有分布,主要集中在心、肝、脾、肺、肾等血流灌注高的组织,尤其在肝、脾组织中浓度较高,肝脏中药物总量占给药剂量的比例最大,给药后15d可占给药量16.5%。XG在各组织中均可被清除。关节腔注射XG后,在粪便中仅有极微量的药物排出,少量通过尿排出,大部分通过呼吸排出。给药后30 d,尿中XG累积排泄量为给药剂量的4.63%,以每天约0.07%给药剂量的速率缓慢经尿排泄。至给药后90 d,呼吸中XG累积排泄量为21.4%,以每天约0.32%给药剂量的速率经呼吸排泄。结论：关节腔注射XG可吸收进入血液循环,并分布至主要组织器官,进行代谢排出体外,但关节腔注射XG在体内消除较慢。4黄原胶代谢初步研究目的：初步考察XG体内代谢规律。方法：测定关节腔注射XG后,血浆、组织及尿液中的XG的Mr范围,探讨XG吸收入血的形式。体外分别用自由基及大鼠肝脏溶酶体与XG共孵育,采用流变仪测定XG黏弹性和多角度激光散射法测定XG Mr的变化,探讨自由基及肝脏溶酶体对XG的降解作用。结果：XG以大分子形式吸收进入血液循环(Mr>1x105),在肝脏组织中主要以大分子形式(M>1×105)存在,可代谢为Mr<1×104的分子从尿液排出。自由基可降低XG的黏弹性。经肝脏溶酶体处理的XG,黏度显著降低,重均相对分子质量(weight average molecular weights,Mw)由4.2x106降至].1×106。结论：XG可以大分子形式吸收进入血液循环,并分布到组织。体内自由基可对XG产生一定降解作用或影响其构象。肝脏溶酶体内可能存在能降解XG的酶。