【摘 要】
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目的:研究IgA肾病患者尿液蛋白质谱特点,结合肾活检技术对不同病理类型及IgA肾病的不同阶段的蛋白质谱进行比较,寻找具有高度特异性与敏感性的尿液蛋白质,探讨蛋白质谱技术对
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目的:研究IgA肾病患者尿液蛋白质谱特点,结合肾活检技术对不同病理类型及IgA肾病的不同阶段的蛋白质谱进行比较,寻找具有高度特异性与敏感性的尿液蛋白质,探讨蛋白质谱技术对该疾病的临床诊断意义。方法:取8例清晨空腹无菌尿液标本,避免污染和蛋白质酶解,进行4℃3000×g离心5分钟以除去细胞及相关成分,取上清液用0.45μm的微孔超滤膜过滤以除去大颗粒杂质,再用-20℃预冷丙酮按照标本体积:丙酮体积为4:1的比例迅速加入进行蛋白沉淀,置于-20℃过夜后,经4℃7000×g高速离心30分钟,弃上清液,留取含尿蛋白的沉淀物,-106℃真空干燥浓缩。PBS充分溶解后用Bradford法(考马斯亮蓝)进行浓度测定,计算出样品的蛋白浓度,取0.8g样品充分酶解后调整蛋白浓度为0.8μg/μl,行HPLC除盐,测得肽峰,获取含肽混合液,-106℃真空干燥浓缩,再行LC-MS/MS(LCQ)质谱分析,设定二级质谱质/荷优化范围为400~2000,质谱分析时间210分钟,洗脱时间30分钟,获得质谱肽序列结果采用BioWorks软件的SEQUEST计算方法行数据库检索,所用的库为ipi.human,v3.05。结果:成功的获得了重复性比较好的尿液蛋白质谱肽序列图谱,获得IgA肾病尿蛋白质共194个,不同病理类型患者的尿蛋白质中有15个具有高度特异性的蛋白质,在International Protein Index(IPI)human数据库中鉴定获得13种蛋白质;病理分型为局灶节段硬化型(Lee氏Ⅲ型)有28种特征表达的蛋白质,局灶增生硬化型(Lee氏Ⅱ型)有36种特征蛋白质表达;病理类型为中度系膜增生型(Lee氏Ⅰ型)患者应用激素治疗2月后患者的尿蛋白临床定量明显减少,但蛋白质谱鉴定其种类无明显减少,治疗前后有36种共同表达蛋白质。结论:本实验采用LC-MS/MS质谱分析的方法鉴定IgA肾病尿液蛋白质,成功的获得了该疾病的多肽序列质谱图,最终得到194个蛋白质。大多数是糖蛋白;尿液蛋白质组中的免疫球蛋白分泌片段、结合珠蛋白、子宫球蛋白可能是提示IgA肾病的生物标记物。
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