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虎杖中的白藜芦醇苷是一种β-糖苷,能被β-葡萄糖苷酶水解为白藜芦醇。β-葡萄糖苷酶主要是来自于微生物中的真菌,比如木霉、曲霉等,酶活力低且温度和pH等稳定性范围较窄,而且β-葡萄糖苷酶的售价高昂,限制了其在工业上的使用。由于自然界中的微生物有99%的是不可培养的,所以利用传统方法发现酶活力高且酶学性质良好的β-葡萄糖苷酶很困难。然而,宏基因组技术直接提取生境中的总DNA,不需要对微生物进行分离和培养,使自然界中不能培养的微生物资源得到充分的利用。本课题对前期实验室从黑龙江玉米土壤中筛选并构建的β-葡萄糖苷酶Bgl2238的重组大肠杆菌(E.coLi BL21(DE3)-pET32a-Bgl2238)采用响应面(Box-Behnken)优化的方法进行摇瓶发酵,最佳培养基配比为:甘油9.32g/L、酵母提取粉12g/L、胰蛋白胨19.13g/L、NaCl 8g/L、K2HPO4·3H2O 19.13g/L、KH2PO4 2g/L、柠檬酸高铁按0.2g/L和微量元素母液6m L/L。重组大肠杆菌Bgl2238最佳的发酵条件为:发酵温度37℃、起始pH 8.0、3%接种量、25m L装液量、IPTG终浓度为0.5mM。在250mL锥形瓶对重组子Bgl2238进行发酵,在最优化的发酵培养基成分和培养条件下,Bgl2238的酶活力可以达到2910U/L,比起始培养基中的酶活提高了61.77%。文中对Bgl2238水解中药材虎杖中白藜芦醇苷的工艺进行了初步的研究,得到了最佳酶解工艺为:加酶量1:4、料液比1:25、酶解时间12h、温度44℃、转速120rpm,白藜芦醇苷的水解率可以达到95%。用95%的乙醇对酶解后的虎杖粉溶液进行了初步的提取,用HPLC检测白藜芦醇的含量为6.87%,比酶解前的含量提高了6倍。为了进一步降低工业中Bgl2238对虎杖水解的成本,本文采用先壳聚糖吸附,再戊二醛交联的方法对Bgl2238进行固定化,不仅可以使Bgl2238重复利用,而且稳定性也得到了提高。通过单因素方法确定了Bgl2238固定化的制备条件和固定化工艺:壳聚糖浓度为2.0%、乙酸的浓度为1.5%、NaOH的浓度为15%、甲醇的浓度为20%、戊二醛浓度为0.5%、最佳交联时间为1h、最佳交联温度为20℃、最佳吸附时间为4h、Bgl2238粗酶液稀释2倍。Bgl2238固定化酶的酶活回收率达到87%,酶活力为859.65mU/g。固定化Bgl2238的最适温度为50℃,比游离的Bgl2238的最适温度提高了6℃,且温度稳定性和pH稳定性都有所改善。为了考察固定化Bgl2238的重复性能,对虎杖连续水解6次后,白藜芦醇苷的水解率仍有70%以上,证明了固定化Bgl2238的重复使用性很好。